1.一種快速制備脫植基葉綠素a和脫植基葉綠素b的方法，包括：
(1)材料準備：新鮮蔬菜葉片和新鮮柑橘果實洗凈晾干，將新鮮柑橘自果皮表層削取的
0.2～0.3mm厚度的表皮，作為新鮮柑橘果皮，備用；
(2)總葉綠素的提取，以下步驟在避光條件下進行：
a.將(1)中洗凈晾干的蔬菜葉片稱取100g，用液氮冷凍，在研缽或樣品破碎儀中磨成細
粉；
b.將樣品粉末與提取液按1g:2mL的比例混合；超聲清洗儀100％功率，冰浴超聲20min
～30min，期間上下混勻樣品數次；4000g～5000g離心5min～10min，取上清；沉淀按上述樣
品粉末與提取液的比例重新加入提取液抽提；重復冰浴超聲、離心和取上清過程，直至殘渣
無色，將收集的上清合并；
所述的提取液為：N,N-二甲基甲酰胺溶液，含0.1％碳酸鎂，w/v；
c.合并的上清分裝至250mL分液漏斗中，每個分液漏斗100mL，按1:1的體積比加入正己
烷混合，充分振蕩后靜置至完全分層；棄上層正己烷相，下層放入新的分液漏斗中，按上述
上清與正己烷的體積比重新加入正己烷，繼續振蕩后靜置分層，棄上層正己烷相，重復該步
驟至上層無色，合并下層液；
d.下層液與正己烷按4:1的體積比混合，劇烈振蕩后-20℃冰箱中放置2～3h；4000g～
5000g離心10min～15min，移除最上層白色乳油狀物及中間層正己烷相；
按下層液和正己烷1:1的體積比繼續加入正己烷，劇烈振蕩后4000g～5000g離心
10min，移除上層，重復該步驟至上層無色，移除上層保留下層液；
e.下層液與10％氯化鈉水溶液按體積比1:5～6混合，振蕩1min，4000g～5000g離心
5min，收集上清；剩余下層繼續與無水乙醚按10:1的體積比混合，振蕩1min，靜置至分層，收
集上清，重復該步驟一遍，將收集的上清合并；加入等體積的1:1,v/v的正己烷:無水乙醚溶
液混合后，再加入5倍體積的10％氯化鈉水溶液，振蕩1min，靜置至分層，合并收集的上清；
加入與上清等體積的正己烷，振蕩后加入無水硫酸鈉至無結塊；上清在避光條件下30℃真
空濃縮儀中干燥或者氮氣吹干，樣品用錫箔紙包裹避光，冰箱中-80℃長期保存或者-20℃
短期保存，得葉綠素粗提干燥物；
(3)葉綠素a和葉綠素b的分離：稱取步驟(2)中所得總葉綠素粗提干燥物10mg，用1:1,
v/v的甲醇：丙酮溶解，配成終濃度2mg/mL，8000g～12000g離心10min～15min，上清經0.22μ
m微孔濾膜過濾后分裝至2mL上樣瓶中；
按常規方式的液相色譜分離法進行葉綠素a和葉綠素b的分離；
(4)脫植基葉綠素a和脫植基葉綠素b的制備
(a)粗酶提取液的準備：稱取步驟(1)中的新鮮柑橘果皮100g，液氮冷凍后，在研缽或樣
品破碎儀中磨成細粉末；
每克樣品粉末中加入1mL-20℃預冷的丙酮，混勻后，超聲清洗儀100％功率，冰浴超聲
10min～15min；4000g～5000g離心5min～10min，棄上清，沉淀繼續加入100mL-20℃預冷的
丙酮，重復上述冰浴超聲、離心、棄上清的過程2～3遍；棄上清后，沉淀在牛皮紙上攤開，通
風櫥中吹5min至干后倒入研缽，加入液氮，研磨成細粉；沉淀繼續加入50mL-20℃預冷的丙
酮，超聲清洗儀100％功率，冰浴超聲10min～15min，4000g～5000g離心5min～10min，棄上
清，重復上述冰浴超聲、離心和棄上清的過程3～4遍至沉淀完全無色；每100g新鮮柑橘果皮
得到的無色沉淀加入50mL緩沖液，充分攪勻所得懸濁液即為1份粗酶提取液；
所述的緩沖液為：丙酮：0.2M Tris-HCl＝1:1，v/v，其中0.2M Tris-HCl的PH為8.0；
(b)脫植基葉綠素a的制備：稱取5mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素a，無水乙醚溶解
配制成500μg/mL，加入1份粗酶提取液混合，用緩沖液補足至100mL；水浴鍋中42℃反應2h，
期間振蕩樣品數次或者磁力攪拌器上42℃恒溫攪拌反應2h；4000g～5000g離心10min，收集
上清；避光條件下，30℃真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箔紙包裹避光，
冰箱中-80℃長期保存或者-20℃短期保存；
(c)脫植基葉綠素b的制備：稱取5mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素b，后續操作同
(b)中所述步驟，樣品用錫箔紙包裹避光，冰箱中-80℃長期保存或者-20℃短期保存。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)中所述的蔬菜葉片為將市場上購買來
的新鮮蔬菜摘選葉片，挑除老葉和黃葉并去掉葉柄，洗凈后陰暗處晾干；所述的新鮮柑橘果
皮為將市場上購買來的新鮮柑橘清水洗凈，晾干，削取表皮，厚度為0.2～0.3mm。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)中進行葉綠素a和葉綠素b的分離時，實
驗室常見的分析型、半制備型或者制備型的液相色譜儀使用常用的C18色譜柱，均用于葉綠
素a和葉綠素b的分離；流動相A為甲醇，流動相B為甲醇：丙酮＝1：1；用50％流動相A+50％流
動相B等度洗脫，分別收集chlorophyll a色譜峰和chlorophyll b色譜峰的餾分，避光條件
下，30℃真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箔紙包裹避光，冰箱中-80℃長
期保存或者-20℃短期保存。
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