本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種低成本的AML1?ETO融合基因快速檢測探針及其制備方法。所述制備方法包括以下步驟：從UCSC Genome Browser下載AML1和ETO基因探針所覆蓋區(qū)域基因組非重復序列，再將分割后的序列批量導入OligoArray軟件進行探針設(shè)計，然后將設(shè)計后的探針加上標簽序列后直接合成，再使用帶有熒光基團的標簽引物對探針進行擴增和標記，得到AML1?ETO融合基因快速檢測探針。本發(fā)明制備所得AML1/ETO融合基因快速檢測探針具有雜交時間短(可在15～30分鐘完成雜交實驗)、雜交信號明亮、信噪比高、制備成本低等優(yōu)點。

1.一種低成本AML1-ETO融合基因快速檢測探針的制備方法，其特征在于，包括如下步
驟：
（1）從UCSC Genome Browser下載AML1和ETO基因探針所覆蓋區(qū)域的基因組非重復序
列，其中AML1探針覆蓋區(qū)域為：chr21: 34787801-35049334，ETO探針覆蓋區(qū)域為：chr8:
91954967-92103365；
（2）將步驟（1）獲得的AML1基因探針所覆蓋區(qū)域的基因組非重復序列使用perl插件程
序chunks.pl分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導入OligoArray 軟件進行探針
設(shè)計、探針篩選，然后將篩選出的探針導出到EXCEL表格中，再分別在每條探針的5’端加上
17bp的標簽序列、3’端加上18bp的標簽序列，得到一系列帶有標簽序列的AML1探針序列；所
述探針篩選的條件為：探針長度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/
CCCC，探針間最小間隔5bp；所述標簽序列的堿基序列如下所示：5’端標簽序列為：
TGTAAAACGACGGCCAG，3’端標簽序列為：GGTCATAGCTGTTTCCTG；
（3）將步驟（1）獲得的ETO基因探針所覆蓋區(qū)域的基因組非重復序列使用perl插件程序
chunks.pl分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導入OligoArray 軟件進行探針設(shè)
計、探針篩選，然后將篩選出的探針導出到EXCEL表格中，再分別在每條探針的5’端加上
17bp的標簽序列、3’端加上18bp的標簽序列，得到一系列帶有標簽序列的ETO探針序列；所
述探針篩選的條件為：探針長度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/
CCCC，探針間最小間隔5bp；所述標簽序列的堿基序列如下所示：5’端標簽序列為：
TGTAAAACGACGGCCAG，3’端標簽序列為：GGTCATAGCTGTTTCCTG；
（4）使用DNA合成儀對步驟（2）所得帶有標簽序列的AML1探針序列進行化學合成，將化
學合成的探針進行混合，制備得到AML1探針庫；同理，使用DNA合成儀對步驟（3）所得帶有標
簽序列的ETO探針序列進行化學合成，將化學合成的探針進行混合，制備得到ETO探針庫；
（5）分別合成5’端帶有綠色熒光基團的M13通用引物和5’端帶有橘紅色熒光基團的M13
通用引物，使用5’端帶有綠色熒光基團的M13通用引物對AML1探針庫進行擴增標記反應，使
用5’端帶有橘紅色的熒光基團的M13通用引物對ETO探針庫進行擴增標記反應；所述通用引
物的序列如下所示：M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-R CAGGAAACAGCTATGACC；
（6）將步驟（5）所得AML1探針庫的擴增標記產(chǎn)物純化、稀釋后即得到熒光標記的AML1探
針庫， 將步驟（5）所得ETO探針庫的擴增標記產(chǎn)物純化、稀釋后即得到熒光標記的ETO探針
庫，所述熒光標記的AML1探針庫和熒光標記的ETO探針庫構(gòu)成了AML1-ETO融合基因快速檢
測探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟（5）所述擴增標記反應的PCR反應體
系如下：
2×PCR Mix 25μL
模板 50ng
M13-F 1μL
M13-R 1μL
H₂O 補足至50μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟（5）所述擴增標記反應的PCR反應條
件如下：95℃5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，共進行35個循環(huán)；72℃10min。
4.一種包含權(quán)利要求1~3任一所述制備方法制備所得AML1-ETO融合基因快速檢測探針
的AML1/ETO融合基因試劑盒。
5.權(quán)利要求4所述試劑盒在制備用于檢測AML1/ETO融合基因產(chǎn)品中的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應用，其特征在于，具體的應用方法包括如下步驟：
（1）樣本處理：將外周血細胞滴片樣本放入盛有2×SSC的容器中，微波爐高火加熱處理
3min直至液體沸騰，然后再中低火繼續(xù)加熱處理10min，處理完成后立即將玻片置于-20℃
預冷的梯度酒精中脫水晾干，備用；
（2）AML1-ETO融合基因快速檢測探針雜交混合物的制備：將熒光標記的AML1探針庫、熒
光標記的ETO探針庫和雜交緩沖液按照1:1:9的體積比混合；
（3）探針樣本共變性：每例樣本使用10μL步驟（2）混合所得AML1-ETO融合基因快速檢測
探針雜交混合物，使用22×22mm蓋玻片蓋片，使用橡皮膠封片，封片后將玻片置于雜交儀中
90℃變性1min，37℃雜交15~30min；
（4）雜交后洗滌：待雜交完成后揭去蓋玻片，將玻片置于60℃預熱的洗液中洗滌去除未
結(jié)合探針；
（5）復染及鏡檢：將晾干的玻片滴加10μL抗淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察
雜交結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應用，其特征在于，步驟（2）中所述雜交緩沖液的組分為：10wt%
去離子甲酰胺、20wt%硫酸葡聚糖、1μg/mLRNaseA、0.6M氯化鈉、10mM檸檬酸緩沖液。