本發(fā)明屬生物、醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測肺炎支原體耐藥突變的方法。本發(fā)明采用Real-time PCR及可分辨單堿基差異的cycling探針技術(shù)，通過在肺炎支原體23SrRNA基因2063位/2064位堿基上下游序列中尋找針對肺炎支原體的特異性引物，根據(jù)肺炎支原體無突變敏感株及突變耐藥株23SrRNA基因2063位/2064位的堿基差異，分別設(shè)計針對無突變敏感株、2063位突變耐藥株及2064位突變耐藥株的特異性cycling探針；采用肺炎支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Real-time PCR擴(kuò)增儀實(shí)時讀取熒光強(qiáng)度變化，確定被檢樣品中的序列的突變類型。本發(fā)明能正確區(qū)分肺炎支原體臨床分離株無突變敏感株和突變耐藥株，特異性為100％。敏感性可達(dá)10拷貝/PCR反應(yīng)。

1.一種用于檢測肺炎支原體耐藥突變的特異性引物及cycling探針，其特征在于，引物序列為：上游引物5’-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3’下游引物5’-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3’；特異性cycling探針序列分別為：FAM熒光標(biāo)記的無突變敏感株檢測探針：5’-(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3’HEX熒光標(biāo)記的2063位突變耐藥株探針：5’-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3’ROX熒光標(biāo)記的2064位突變耐藥株探針：5’-(Eclipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3’其中，粗體小寫字母為cycling探針引入的RNA堿基；所述特異性引物及探針可應(yīng)用于如下步驟的檢測肺炎支原體耐藥突變的方法：1)在肺炎支原體23S?rRNA基因2063位/2064位堿基上下游序列中尋找針對肺炎支原體的特異性引物，引物序列為：?上游引物5’-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3’?下游引物5’-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3’;??2)根據(jù)肺炎支原體無突變敏感株及突變耐藥株23S?rRNA基因2063位/2064位的堿基差異，分別設(shè)計針對無突變敏感株、2063位突變耐藥株及2064位突變耐藥株的特異性cycling探針；?所述特異性cycling探針及其序列分別為：?FAM熒光標(biāo)記的無突變敏感株檢測探針：5’-(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3’?HEX熒光標(biāo)記的2063位突變耐藥株探針：5’-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3’?ROX熒光標(biāo)記的2064位突變耐藥株探針：5’-(Eclipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3’3)采用肺炎支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Real-time?PCR擴(kuò)增儀實(shí)時讀取熒光強(qiáng)度變化，確定被檢樣品中的序列的突變類型。2.按權(quán)利要求1所述的特異性引物及cycling探針，其特征在于，不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的相應(yīng)探針與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物完全匹配雜交，并被Rnase?H切斷釋放特定熒光，通過Real-time?PCR擴(kuò)增儀實(shí)時讀取其熒光強(qiáng)度變化。3.?按權(quán)利要求2所述的特異性引物及cycling探針，其特征在于，所述的HEX標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被Rnase?H切斷釋放HEX熒光，而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交，不被RnaseH切斷釋放熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)增加，產(chǎn)物累積致使HEX熒光強(qiáng)度增強(qiáng),生成HEX熒光強(qiáng)度逐漸上升的擴(kuò)增曲線,無2063位突變的則維持在水平的基線附近。4.按權(quán)利要求2所述的特異性引物及cycling探針，其特征在于，所述的FAM標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被Rnase?H切斷釋放FAM熒光，而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交，不被RnaseH切斷釋放熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)增加，產(chǎn)物累積致使FAM熒光強(qiáng)度增強(qiáng),生成FAM熒光強(qiáng)度逐漸上升的擴(kuò)增曲線,無突變的則維持在水平的基線附近。5.按權(quán)利要求2所述的特異性引物及cycling探針，其特征在于，所述的ROX熒光標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被Rnase?H切斷釋放FAM熒光，而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交，不被Rnase?H切斷釋放熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)增加，產(chǎn)物累積致使ROX熒光強(qiáng)度增強(qiáng),生成ROX熒光強(qiáng)度逐漸上升的擴(kuò)增曲線,無2064位突變的則維持在水平的基線附近。