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一種檢測肺炎支原體耐藥突變的方法

  • 專利類型:發(fā)明專利
  • 有效期:不限
  • 發(fā)布日期:2021-12-16
  • 技術(shù)成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態(tài)核實(shí)
  • 簽署交易協(xié)議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(shù)(專利)類型 發(fā)明專利
  • 申請?zhí)?專利號 CN200910198573.9 
  • 技術(shù)(專利)名稱 一種檢測肺炎支原體耐藥突變的方法 
  • 項(xiàng)目單位 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院
  • 發(fā)明人 徐曉剛,劉楊,王明貴 
  • 行業(yè)類別 醫(yī)藥制造-化學(xué)藥品制劑
  • 技術(shù)成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯(lián)系人 朱仁丹
  • 發(fā)布時間 2021-12-16  
  • 01

    項(xiàng)目簡介

    本發(fā)明屬生物、醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種檢測肺炎支原體耐藥突變的方法。本發(fā)明采用Real-time PCR及可分辨單堿基差異的cycling探針技術(shù),通過在肺炎支原體23SrRNA基因2063位/2064位堿基上下游序列中尋找針對肺炎支原體的特異性引物,根據(jù)肺炎支原體無突變敏感株及突變耐藥株23SrRNA基因2063位/2064位的堿基差異,分別設(shè)計針對無突變敏感株、2063位突變耐藥株及2064位突變耐藥株的特異性cycling探針;采用肺炎支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過Real-time PCR擴(kuò)增儀實(shí)時讀取熒光強(qiáng)度變化,確定被檢樣品中的序列的突變類型。本發(fā)明能正確區(qū)分肺炎支原體臨床分離株無突變敏感株和突變耐藥株,特異性為100%。敏感性可達(dá)10拷貝/PCR反應(yīng)。
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  • 02

    說明書

    1.一種用于檢測肺炎支原體耐藥突變的特異性引物及cycling探針,其特征在于,引物序列為:上游引物5’-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3’下游引物5’-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3’;特異性cycling探針序列分別為:FAM熒光標(biāo)記的無突變敏感株檢測探針:5’-(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3’HEX熒光標(biāo)記的2063位突變耐藥株探針:5’-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3’ROX熒光標(biāo)記的2064位突變耐藥株探針:5’-(Eclipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3’其中,粗體小寫字母為cycling探針引入的RNA堿基;所述特異性引物及探針可應(yīng)用于如下步驟的檢測肺炎支原體耐藥突變的方法:1)在肺炎支原體23S?rRNA基因2063位/2064位堿基上下游序列中尋找針對肺炎支原體的特異性引物,引物序列為:?上游引物5’-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3’?下游引物5’-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3’;??2)根據(jù)肺炎支原體無突變敏感株及突變耐藥株23S?rRNA基因2063位/2064位的堿基差異,分別設(shè)計針對無突變敏感株、2063位突變耐藥株及2064位突變耐藥株的特異性cycling探針;?所述特異性cycling探針及其序列分別為:?FAM熒光標(biāo)記的無突變敏感株檢測探針:5’-(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3’?HEX熒光標(biāo)記的2063位突變耐藥株探針:5’-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3’?ROX熒光標(biāo)記的2064位突變耐藥株探針:5’-(Eclipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3’3)采用肺炎支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過Real-time?PCR擴(kuò)增儀實(shí)時讀取熒光強(qiáng)度變化,確定被檢樣品中的序列的突變類型。2.按權(quán)利要求1所述的特異性引物及cycling探針,其特征在于,不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的相應(yīng)探針與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物完全匹配雜交,并被Rnase?H切斷釋放特定熒光,通過Real-time?PCR擴(kuò)增儀實(shí)時讀取其熒光強(qiáng)度變化。3.?按權(quán)利要求2所述的特異性引物及cycling探針,其特征在于,所述的HEX標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被Rnase?H切斷釋放HEX熒光,而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交,不被RnaseH切斷釋放熒光,隨PCR循環(huán)數(shù)增加,產(chǎn)物累積致使HEX熒光強(qiáng)度增強(qiáng),生成HEX熒光強(qiáng)度逐漸上升的擴(kuò)增曲線,無2063位突變的則維持在水平的基線附近。4.按權(quán)利要求2所述的特異性引物及cycling探針,其特征在于,所述的FAM標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被Rnase?H切斷釋放FAM熒光,而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交,不被RnaseH切斷釋放熒光,隨PCR循環(huán)數(shù)增加,產(chǎn)物累積致使FAM熒光強(qiáng)度增強(qiáng),生成FAM熒光強(qiáng)度逐漸上升的擴(kuò)增曲線,無突變的則維持在水平的基線附近。5.按權(quán)利要求2所述的特異性引物及cycling探針,其特征在于,所述的ROX熒光標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被Rnase?H切斷釋放FAM熒光,而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交,不被Rnase?H切斷釋放熒光,隨PCR循環(huán)數(shù)增加,產(chǎn)物累積致使ROX熒光強(qiáng)度增強(qiáng),生成ROX熒光強(qiáng)度逐漸上升的擴(kuò)增曲線,無2064位突變的則維持在水平的基線附近。
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