本發明公開一種檢測口含煙制品對細胞超氧化物歧化酶影響的方法，包括以下步驟：(1)受試物的前處理；(2)人口腔角質細胞單細胞懸浮液的制備；(3)人口腔角質細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算；(4)人口腔角質細胞單細胞懸浮液的細胞接種；(5)受試物的分組；(6)受試物檢測劑量的設定；(7)受試物培養品的制備；(8)受試物的孵育；(9)受試物孵育品的收集；(10)樣品制備；(11)樣品測定；(12)蛋白濃度測定；(13)超氧化物歧化酶酶活力的計算。本發明對樣品的有效處理、檢測劑量的優化設定以及靶細胞的正確選擇，使得本方法能夠準確有效的檢測口含煙制品對細胞超氧化物岐化酶酶活力影響的方法。

1.一種檢測口含煙制品對細胞超氧化物歧化酶影響的方法，其特征在于，包括以下具體步驟：(1)受試物的前處理：準確稱取1.0g口含煙制品，加入30mL無血清培養基，于37℃下靜置24h，萃取，萃取后先用定性濾紙進行初濾除渣處理，再用0.45μm有機濾膜過濾除菌，得到待測液；(2)人口腔角質細胞單細胞懸浮液的制備：人口腔角質細胞復蘇后，接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5vt％CO₂培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用OKM細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；(3)人口腔角質細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人口腔角質細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人口腔角質細胞單細胞懸浮液的活細胞數；(4)人口腔角質細胞單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數后的人口腔角質細胞單細胞懸浮液加入OKM細胞培養基稀釋至2.0×10⁵個/mL，接種到直徑為60mm細胞培養皿中，每皿4mL，將細胞培養板置于37℃、5vt％CO₂培養箱內培養24h；(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構成為：細胞對照組為OKM細胞生長培養基上種植人口腔角質細胞；檢測樣品組為在OKM細胞生長培養基上種植人口腔角質細胞并添加受試物；(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：12.5％樣品萃取液、25％樣品萃取液、50％樣品萃取液、75％樣品萃取液、100％樣品萃取液；(7)受試物培養品的制備：移除步驟(4)中直徑為60mm細胞培養皿內的OKM細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：細胞對照組為OKM細胞培養基+人口腔角質細胞；檢測樣品組為OKM細胞培養基+人口腔角質細胞+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；用OKM細胞培養基將每孔液體體積補足至4mL；(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的直徑為60mm細胞培養皿置于37℃、5vt％CO₂培養箱中孵育24h；(9)受試物孵育品的收集：去除步驟(8)中的培養基，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用OKM細胞培養液懸起，1000rpm低溫離心10min；(10)樣品制備：收集(9)步驟得到的細胞，加入100μL細胞裂解液，細胞裂解需在冰浴下進行，裂解后收集細胞，1600rpm低溫離心10min，取上清液待后續測定；(11)樣品測定：在不同離心管內加入20μL樣品待測液，空白對照1加入20μL檢測緩沖液，空白對照2加入40μL檢測緩沖液；檢測樣品組和空白對照組分別加入180μL氮藍四唑顯色工作液，37℃下孵育30分鐘，于560nm測定吸光度；(12)蛋白濃度測定：測定樣品蛋白濃度；(13)超氧化物歧化酶酶活力計算：a.抑制百分率的計算：根據(11)測定的標準溶液吸光度值計算抑制百分率，抑制百分率＝(A空白對照1－A樣品)/(A空白對照1－A空白對照2)×100％b.SOD酶活力的計算：待測樣品中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)unitsSOD酶酶活性(U/mg)＝待測樣品中SOD酶活力單位/樣品蛋白量(mg)。