一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8及其構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的表達載體pDXW-8，能在大腸桿菌和棒狀桿菌中復制并穩(wěn)定存在，含有一個在大腸桿菌和棒狀桿菌中皆具有轉(zhuǎn)錄啟動功能的tac啟動子，及轉(zhuǎn)錄終止功能的終止子rrnBT1T2；含有一個用于棒狀桿菌轉(zhuǎn)化子選擇的抗性標記卡那霉素標記抗性基因；含有一個用于嚴謹控制tac啟動子表達的負調(diào)控基因lacI；含有一個包含11個單一的限制性內(nèi)切酶切點的多克隆位點MCS。在棒狀桿菌中，該載體表達外源蛋白的水平適中，尤其適用于棒狀桿菌代謝工程的研究。

1.一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導表達載體pDXW-8，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO：1。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體pDXW-8，其特征在于：含有用于嚴謹控制tac啟動子表達的負調(diào)控基因lacI^PF104，從6985到5903位，其攜帶的外源啟動子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列為cagcgtattt?gaccgatccg?gacacctggg?ataatgtgtg?gattttgtcg?gtg?gtgaat，其中劃線部分為啟動子PF104序列，加框部分為SD序列；含有用于克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位點MCS，從9546位到9472位，包含如下11個單一的限制性內(nèi)切酶切點EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII，其核苷酸序列為gaattcgctagcgagctccc?atgggcggcc?gcctcgaggg?taccagatct?ccgcggctta?agctgcagaa?gctt。3.如權(quán)利要求1或2所述的表達載體pDXW-8的構(gòu)建方法，其特征是：以質(zhì)粒pET-28a為模板，kan-F和kan-R為引物，通過PCR擴增1023bp的kan基因，在擴增產(chǎn)物的5′和3′末端引入限制酶SgrAI酶切位點，PCR產(chǎn)物用SgrAI酶切；pKK223-3同樣用SgrAI酶切，用堿性磷酸酶CIAP去磷酸化；兩者連接，由此產(chǎn)生的質(zhì)粒大小為5617bp，命名為pDXW-5；以質(zhì)粒pC2為模板，rep-F和rep-R為引物，通過PCR擴增2686bp的rep片段，在擴增產(chǎn)物的5′和3′末端引入限制酶PshAI酶切位點，PCR產(chǎn)物用PshAI酶切，并連接到同樣用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5，由此產(chǎn)生的質(zhì)粒大小為8313bp，命名為pDXW-6；為了證明rep片段和kan基因在棒狀桿菌中的功能，我們用質(zhì)粒pDXW-6轉(zhuǎn)化黃色短桿菌B.flavum，并選擇卡那霉素抗性克隆；以質(zhì)粒pET-28a為模板，攜帶PF104序列的正向引物lacI-F，和反向引物lacI-R為引物，通過PCR擴增1191bp的lacI^PF104基因，在擴增產(chǎn)物的5′和3′末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位點，PCR產(chǎn)物用EcoRI和HindIII雙切，并連接到同樣用EcoRI和HindIII雙切后的pDXW-6，由此產(chǎn)生的質(zhì)粒大小為9510bp，命名為pDXW-7；人工合成的74bp多克隆位點MCS的DNA片段5′gaattcgcta?gcgagctcccatgggcggcc?gcctcgaggg?taccagatct?ccgcggctta?agctgcagaa?gctt?3’，它包含有11個單一的限制性內(nèi)切酶切點：EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII；用EcoRI和HindIII雙切74bp的多克隆位點MCS片段，并連接到同樣用EcoRI和HindIII雙切的pDXW-7上，取代pDXW-7原有的多克隆位點，對該構(gòu)建質(zhì)粒的MCS及其兩翼進行測序，以驗證MCS正確連接到pDXW-7上，構(gòu)建的質(zhì)粒大小為9548bp，并命名為pDXW-8；以質(zhì)粒pDXW-8為模板，分別用引物對kan/rep-D/kan-F，kan/rep-D/kan-R，kan/rep-D/rep-F，kan/rep-D/rep-R，lacI-D/lacI-F，及l(fā)acI-D/lacI-R進行DNA片段的PCR擴增，鑒定了質(zhì)粒pDXW-8上kan基因插入方向為正向插入，rep和lacI^PF104片段的插入方向均為反向插入；以上所述的PCR擴增所需引物序列：kan-F：agcacaccgg?cgctttgatc?ttttctacgg?ggtckan-R：agcacaccgg?cgtcaggtgg?cacttttcgg?ggaarep-F：agtagactat?cgtccattgt?caacaacaag?acccatcarep-R：agtagactat?cgtcgtctac?gtctgatgct?ttgaatcglacI-F： gctgtatacc?agcgtatttg?accgatccgg?acacctggga?taatgtgtgg?attttgtcgggaaaggatgg?tgaatatgaa?accagtaacglacI-R：gtatacggtg?cctaatgagt?gagctaacttKan/rep-D：ctcacaattc?cacacattat?acgalacI-D：acacggaggc?atcaagtgac?caaaPCR反應條件：擴增kan基因PCR反應：所用引物為kan-F，kan-R；退火溫度57℃，延伸時間75s；擴增rep片段PCR反應：所用引物為rep-F，rep-R，退火溫度61℃，延伸時間165s；擴增lacI^PF104基因PCR反應：所用引物為lacI-F，lacI-R，退火溫度59℃，延伸時間75s；確定kan基因正向插入PCR反應：所用引物為Kan/rep-D，Kan-R，退火溫度57℃，延伸時間75s；確定kan基因反向插入PCR反應：所用引物為Kan/rep-D，Kan-F，退火溫度57℃，延伸時間75s；確定rep片段正向插入PCR反應：所用引物為Kan/rep-D，rep-R，退火溫度57℃，延伸時間255s；確定rep片段反向插入PCR反應：所用引物為Kan/rep-D，rep-F，退火溫度57℃，延伸時間255s；確定lacI^PF104基因正向插入PCR反應：所用引物為lacI-D，lacI-R，退火溫度59℃，延伸時間105s；確定lacI^PF104基因反向插入PCR反應：所用引物為lacI-D，lacI-F，退火溫度59℃，延伸時間105s。