1.穩定高表達OS-9的細胞株在制備降低對腸粘膜通透性破壞或提高腸上皮細胞中的
緊密連接蛋白表達量的藥物中的應用，其特征在于，所述穩定高表達OS-9的細胞株的構建
方法包括：將plenti6.3載體和OS-9基因連接，并轉化感受態大腸桿菌；將轉后的大腸桿菌
進行質粒提取，獲得plenti6.3-OS-9質粒；以所述plenti6.3-OS-9質粒轉染293T細胞，收獲
病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2細胞后篩選出陽性克隆，培養10-15天后，獲得穩定高
表達OS-9的細胞株。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述構建方法具體包括以下步驟：
1)、提取傳代培養后Caco-2細胞的mRNA，并進行逆轉錄，得到cDNA；
2)、以所述cDNA為模板，進行PCR擴增、電泳以及切膠回收，得到全長OS-9基因；
3)、將所述全長OS-9基因酶切后與plenti6.3載體進行連接，并導入DH5α感受態細胞中
進行轉化，得到轉化后DH5α；
4)、對轉化后DH5α進行質粒提取，獲得plenti6.3-OS-9質粒；
5)、以所述plenti6.3-OS-9質粒轉染293T細胞，收獲病毒液，并以所述病毒液感染
Caco-2細胞后篩選出陽性克隆，培養10-15天后，獲得穩定高表達OS-9的細胞株。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，在步驟2)中，所述PCR擴增的過程中，所用
的引物包括上游擴增引物、下游擴增引物以及中間缺失拼接引物；
其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；所述下游擴增引物如
SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示；所述中間缺失拼接引物的序列如SEQ ID NO：5-SEQ ID
NO：12所示。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，在步驟2)中，所述PCR擴增具體包括如下步
驟：
以所述cDNA為模板，分別以上游引物、下游引物和中間缺失拼接引物進行擴增，獲得3
個擴增產物；
以3個擴增產物為模板，以如SEQ ID NO：1和如SEQ ID NO：4所示序列為引物，進行擴
增。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，在步驟3)中，所述酶切反應的體系為：PacI
0.8-1.2μl，PmeI 0.8-1.2μl，10×buffer 1.8-2.2μl，OS-9基因1.8-2.2μg，ddH2O補至20μ
l。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，在步驟3)中，所述連接的過程中采用T4DNA
連接酶，且反應溫度為15-17℃。
7.根據權利要求2-6任一項所述的應用，其特征在于，在步驟5)中，具體包括：
a)、將plenti6.3-OS-9質粒和包裝質粒等量混合，得到稀釋后plenti6.3-OS-9質粒；
b)、將所述稀釋后plenti6.3-OS-9質粒與轉染試劑Lipo2000混合后孵育15-25分鐘，得
到DNA與轉染試劑復合物；
c)、將所述DNA與轉染試劑復合物滴加到293T細胞培養液中，于36-38℃、4-6％的CO2的
條件下分段培養90-100小時后，離心，過濾，得到病毒液；
d)、將所述病毒液接種于含有Caco-2細胞的培養液中進行培養，并在培養液中加入殺
稻瘟菌素，每隔兩天換液一次，并加入新的殺稻瘟菌素，持續培養10-15天獲得穩定高表達
OS-9的細胞株。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，在步驟c)中，所述離心的轉速為2800-3200
轉/分鐘，時間為10-20分鐘；所述過濾的過程中，濾徑為0.4-0.5微米。
9.權利要求1-8任一項所述的應用中構建獲得的穩定高表達OS-9的細胞株在制備通過
提高claudin-1和occludin的表達量增強腸粘膜屏障功能的藥物中的應用。
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