本發明提出了一利用黃素熒光蛋白錨定并優化展示甲基對氧硫磷水解酶的方法。其步驟為：1)構建融合基因(HMPH?EcFbFP)；2)構建重組質粒pET23a/HMPH?EcFbFP，同時將通過PCR將帶電荷多肽6×Glu的編碼序列引入融合蛋白(HMPH?EcFbFP)編碼基因的3’端，并構建重組質粒pET23a/HMPH?EcFbFP；3)重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，獲得基因工程菌株；4)將重組菌株搖瓶培養，并分別提取細胞各組份，檢測表面展示效率；5)測量甲基對氧硫磷水解酶的酶活；6)對MPH表面展示的穩定性進行測量。本發明首次以黃素熒光蛋白(EcFbFP)作為錨定蛋白，將MPH在大腸桿菌中表面展示，展示效率高，制備的MPH酶活穩定性好。

1.一利用黃素熒光蛋白錨定并優化展示甲基對氧硫磷水解酶的方法，其特征在于步驟為：1)重組質粒構建：首先，設計構建融合基因H₆MPH-EcFbFP；其次，將融合基因H₆MPH-EcFbFP克隆到表達載體pET23a-T，構建重組表達質粒pET23a/H₆MPH-EcFbFP；然后，設計PCR引物攜帶編碼負電荷多肽6×Glu的基因序列，通過PCR將6×Glu的編碼基因序列引入重組質粒pET23a/H₆MPH-EcFbFP，構建重組表達質粒pET23a/H₆MPH-EcFbFP_(E6)，以將負電荷多肽6×Glu引入到黃素熒光蛋白EcFbFP的羧基端；黃素熒光蛋白EcFbFP氨基酸序列如序列表SEQID NO.1所示；甲基對氧硫磷水解酶MPH氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；2)重組菌株構建：將構建好的兩種重組質粒轉化大腸桿菌表達菌株Rosetta Blue感受態細胞，并涂布于LA平板，37℃靜置培養16h，獲得重組菌株；3)重組菌株培養和表達：接種重組菌株于氨芐青霉素濃度100μg/mL的LB培養基中誘導培養，培養條件為：首先，37℃200RPM震蕩培養，在OD值為0.5～0.6之間，加入IPTG，終濃度為1mM，37℃繼續誘導培養8小時；然后，12000RPM，4℃，10分鐘離心收集菌體，菌體用預冷PBS清洗3次，重懸于10mL的預PBS中備用；4)細胞組份提取：取1mL菌液，12000RPM，4℃，離心2分鐘收集菌體，將菌體重懸于1mL預冷的TES緩沖液中，靜置5分鐘，12000RPM，離心10分鐘，離心后的上清定義為細胞外膜組份；將沉淀重懸于1mL預冷的MgCl₂緩沖液中，4℃靜置30分鐘，12000RPM，離心10分鐘，離心后的上清定義為細胞周質組份；將沉淀重懸于1mL預冷的PBS緩沖液之中，定義為細胞胞質組份；5)細胞表面展示效率測定：分別取200μL步驟4中的上述各細胞組份，用SDS-PAGE檢測；經考馬斯亮藍染色之后，采用灰度掃描的方法來計算各組份中的目的蛋白占總目的蛋白的比例，以此來計算出MPH的展示效率；6)細胞表面展示MPH活性測定：收集經IPTG誘導后的細胞培養物，用pH至為8.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于含50μM CoCl₂的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中，并調整其OD₆₀₀為1.0，1000μL酶活反應體系中包含OD₆₀₀為1.0的菌懸液200μL，37℃反應2分鐘，測定410nm處的吸收值的變化，1個MPH酶活單位(U)定義為每分鐘水解1μM甲基對氧磷所需的酶量；7)展示MPH穩定性測定：參照步驟6中的方法，每天在相同的時間內對同一份樣品進行酶活測定，連續測量31天，并繪制酶活的變化趨勢。