1.獲得超量表達
yerP基因菌株FMB?45的方法,其特征在于:
(1)yerP基因超量表達載體pHCMC-YerP的構建 設計引物P43-F和P43-R,以枯草芽孢桿菌(
Bacillus?subtilis)ATCC?9943基因組DNA為模板PCR擴增P43啟動子基因,獲得300?bp基因片段;設計引物YerP-F和YerP-R,以枯草芽孢桿菌(
Bacillus?subtilis)ATCC?9943基因組DNA為模板PCR擴增YerP基因表達框,獲得3195?bp基因片段;擴增得到的兩個基因分別克隆至pMD19-T載體,轉化大腸桿菌(
Escherichia?coli)DH5a,經驗證、測序正確后,分別命名為p
P43-T、p
YerP-T,于-20℃條件下保存備用;
名稱 序列 酶切位點
YerP-F 5’GCGGGATCCATGACCAGTCAGTCAATAAAAAATG3’ BamHI
YerP-R 5’CGGCCCGGGTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3’ SmaI
P43-F 5’CGCGAGCTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGC3’ SacI
P43-R 5’GCGGGATCCCATGTGTACATTCCTCTCTT3’ BamHI
p
P43-T用
BamHI/
SacI雙酶切后獲得P43啟動子基因片段,與經過相同雙酶切處理的pHCMC04載體,用T
4DNA連接酶連接,構建pHCMC-P43載體,酶切驗證正確后于-20℃條件下保存備用;p
YerP-T用
BamH/
SmaI雙酶切后獲得
YerP片段,與經過相同雙酶切處理的pHCMC-P43載體,用T
4?DNA連接酶連接,構建pHCMC-YerP載體,酶切驗證正確后,轉化大腸桿菌DH5a,用于下一步轉化;
(2)FMB45菌株的構建 以枯草芽孢桿菌ATCC?9943制備感受態細胞,采用電轉化方法,將獲得的
yerP基因超量表達載體pHCMC-YerP轉化入枯草芽孢桿菌ATCC?9943,氯霉素平板上篩選得到氯霉素抗性菌株,命名為FMB?45;質粒pHCMC-YerP在枯草桿菌ATCC?9943中過量表達
yerP基因,使菌株FMB?45成為超量表達
yerP基因的突變菌株,即為所得到的菌株。2.權利要求1所述方法獲得的超量表達
yerP基因菌株FMB?45。3、權利要求2所述超量表達
yerP基因菌株FMB?45在生產枯草芽孢桿菌抗菌肽中的應用。