本發明公開了一種高水平分泌表達人白細胞介素8的方法和酵母轉化子，主要包括以下步驟：克隆人IL-8基因；構建真核表達載體；轉化重組載體到真核酸母宿主中；通過篩選，得到了一株高水平分泌表達的酵母轉化子；酵母宿主中表達重組人IL-8蛋白，經硫酸銨沉淀和CM-陽離子交換層析兩步法，快速得到了純度達95％以上的重組人IL-8蛋白。本發明改變了傳統的用原核宿主大腸桿菌表達IL-8，探索出用真核宿主畢赤酵母來表達IL-8的方法，并篩選到了高水平分泌表達酵母轉化子，通過硫酸銨沉淀及CM-陽離子交換層析快速獲得取高純度的重組人IL-8蛋白，本方法既保證了IL-8的生物學活性，又快速獲得了大量穩定的蛋白。

1.分泌表達人白細胞介素8的方法，其特征在于：主要包括以下步驟：
(1)L-8基因：以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該
cDNA為模板，用IL-8特異引物擴增出完整人重組IL-8基因片段，所用IL-8特異引物中引
入Xho?I酶切位點和在未端引入Xba?I酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，
得質粒rhIL-8/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；
(2)構建真核表達載體：將表達載體pPICZαA和質粒rhIL-8/pMD20-T經過Xho?I及Xba
I雙酶切后純化回收，并利用T4DNA連接酶于16±1℃連接下12±1小時，得重組載體
pPICZ?αA-IL-8；
(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中：重組載體pPICZαA-IL-8用SacI單酶切線性化后，
用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆；
(4)陽性克隆轉接至含有高濃度Zeocin的YPD平板，篩選到了高Zeocin抗性的轉化子，
高抗性轉化子以BMGY培養基培養至光密度值＞2.0，離心收集細胞沉淀，用BMMY培養基重懸
細胞并使其中甲醇濃度為1.0％，誘導48±1小時后，經SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌
表達rhIL-8酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhIL-8超過250mg/mL；
(5)高水平分泌表達酵母轉化子于BMGY培養基培養至光密度值＞2.0，離心收集細胞沉淀，
用BMMY培養基重懸細胞并使其中甲醇濃度為1.0％，溫度在28±1℃繼續誘導培養72±1小
時，每24小時補加甲醇使其中濃度保持1.0％，大量發酵表達rhIL-8，表達出的蛋白分泌在
培養基中；
(6)誘導后的酵母轉化子上清液，利用硫酸銨沉淀和CM-陽性子交換層析兩步法，快速純
化得到線度達95％以上的重組蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述IL-8特異引物為：
5’-GC?CTC?GAG?AAA?AGA?GAA?GGT?GCA?GTT?TTG?CCA?AG-3’
5’-GC?TCT?AGA?TTA?TGA?ATT?CTC?AGC?CCT?CTT?C-3’。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(6)為：誘導后的酵母轉化子上清
液于4℃離心，收集離心后的上清液；利用80％相對飽和濃度的硫酸銨對上清液于4℃
過夜沉淀后，高速離心，收獲離心所得的沉淀；所得沉淀重新溶解到含有20mM磷酸鈉的
磷酸鹽緩沖液中，所得溶液上樣至CM-陽離子交換層析柱，用含有0.05M?NaCl的20mM
磷酸鹽緩沖液漂洗CM-陽離子交換層析柱，最后，利用0.15M?NaCl的20mM磷酸鹽緩沖
液對CM-陽離子交換層析柱進行洗脫。
4.一種高水平分泌表達rhIL-8的酵母轉化子，其特征在于：它是由以下方法得到的：
(1)L-8基因：以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該
cDNA為模板，用IL-8特異引物擴增出完整人重組IL-8基因片段，所用IL-8特異引
物中引入Xho?I酶切位點和在未端引入Xba?I酶切位點；回收PCR產物邊接到質粒
pMD20-T載體，得質粒rhIL-8/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；
(2)構建真核表達載體：將表達載體pPICZ?αA和質粒rhIL-8/pMD20-T經過Xho?I及Xba?I
雙酶切后純化回收，并利用T4DNA連接酶于16±1℃連接下12±1小時，得重組載體
pPICZαA-IL-8；
(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中：重組載體pPICZ?αA-IL-8用SacI單酶切線性化后，
用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克??；
(4)陽性克隆轉接至含有高濃度800-1200μg/mLZeocin的YPD平板，篩選到了高Zeocin
抗性的轉化子，高抗性轉化子以BMGY培養基培養至光密度值＞2.0，離心收集細胞沉淀，
用BMMY培養基重懸細胞并使其中甲醇濃度為1.0％，誘導48±1小時后，經SDS-PAGE
分析，得到了高水平分泌表達rhIL-8酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhIL-8
超過250mg/mL。
5.根據權利要求4所述的高水平分泌表達rhIL-8酵母轉化子，其特征在于：所述IL-8特異
引物為：
5’-GC?CTC?GAG?AAA?AGA?GAA?GGT?GCA?GTT?TTG?CCA?AG-3’
5’-GC?TCT?AGA?TTA?TGA?ATT?CTC?AGC?CCT?CTT?C-3’。