本發明公開了一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒。該抗性表達盒含有精簡后的潮霉素抗性基因（SEQ ID NO:1所示），以及位于潮霉素抗性基因兩端的dif1和dif2序列。本發明精簡后的Hyg基因序列由原來的1.7kb縮短至1kb左右，去掉了轉錄終止子，較長的天然啟動子等復雜結構，便于PCR擴增，內部酶切位點更少（常見酶切位點已被定點突變掉），同時，Hyg自帶短的人工啟動子，在大腸桿菌和分枝桿菌中均可表達，定向插入時不影響下游基因的轉錄和翻譯。本發明的抗性表達盒在精簡后的Hyg基因兩端添加了dif序列，可以在分枝桿菌中自動解離。Hyg基因丟失后，被破壞的基因仍可繼續表達縮短的小肽，不影響下游基因的翻譯，從而可有效避免極性效應。

1.一種精簡改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。2.一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒，含有精簡后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因兩端的dif1和dif2序列，其特征在于，所述精簡后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，dif1和dif2序列分別如SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8所示。3.根據權利要求2所述的抗性表達盒，其特征在于，所述表達盒兩段還添加了多重酶切位點。4.根據權利要求3所述的抗性表達盒，其特征在于，所述抗性表達盒的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5或SEQ?ID?NO:6所示。5.含有權利要求2～4任一項所述抗性表達盒的重組質粒。6.根據權利要求5所述的重組質粒，其特征在于，所述質粒的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。7.一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的重組質粒，其含有：啟動子、噬菌體整合位點、整合酶基因、權利要求2～4任一項所述的抗性表達盒、復制起始位點。8.根據權利要求7所述的重組質粒，其特征在于，按順時針方向，依次含有噬菌體整合位點、整合酶基因、權利要求2～4任一項所述的抗性表達盒。9.根據權利要求7或8所述的重組質粒，其特征在于，所述啟動子為LacZ啟動子或BLA啟動子，所述復制起始位點為大腸桿菌復制起點。10.根據權利要求7或8所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。