1.一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法,其特征在于,其是由下列
步驟制備而成:
(1)脫細胞臍血管支架的制備:
選擇離體臍帶備用;從該臍帶上截取15cm長的臍血管置于0~4℃肝素生理
鹽水中保存備用;然后將外徑為4~6mm的玻璃棒插入該臍血管管腔內;修剪該
血管外膜,使所述外膜厚度為650μm~800μm;將該臍血管置于0.25%胰蛋白酶
中4℃保存24小時,PBS液沖洗3次,然后置于1%SDS液中24小時;PBS液沖洗
3次后置于青鏈霉素雙抗中12小時;最后再使用PBS沖洗3次備用;
(2)平滑肌細胞的制備:
取離體無菌臍血管于生理鹽水中漂洗至血污清除干凈為止;后用D-Hanks
液沖洗清除血細胞;游離出臍動脈:將一根直徑為2~3mm的玻璃棒插入臍動脈
內腔,清除該游離出的臍動脈外周脂肪組織;然后用0.25%胰蛋白酶溶液消化該
臍動脈血管壁內皮細胞后,剪開血管壁,采用貼壁法接種平滑肌細胞于培養皿中;
當原代細胞生長成致密單層細胞時,傾去瓶中培養液;加入0.25%胰蛋白酶在室
溫作用3分鐘,在倒置顯微鏡下觀察見細胞收縮,邊緣清楚時停止消化;倒去消
化液加入含10%小牛血清培養液,用吸管吹打細胞制成細胞懸液;取二分之一細
胞懸液接種到新的培養瓶中每3天換液1次,當細胞鋪滿瓶壁時用同法進行傳代;
培養至第3~4代,進行HE染色,免疫組織化學檢查和細胞計數,備用;
(3)成纖維細胞的制備:
取離體真皮組織,用經HBSS平衡的Hanks沖洗并切碎;然后在含0.25%胰
蛋白酶的RPMR?1640完全培養基中培養1~12小時;離心,細胞種植培養;培養
過程中首先貼壁的細胞為成纖維細胞,選擇具有典型的成纖維細胞形態的細胞,
加入含10%FBS和100U/mL青霉素、鏈霉素的RPMR?1640的完全培養液中,放
入含5%CO2、37℃孵箱中培養;12小時后更換培養液,以后每3~4天更換1
次完全培養液,當細胞長成梭形,融合至85%,將細胞用胰蛋白酶消化傳代,備
用;
(4)內皮祖細胞或間充質干細胞的制備:
取離體骨髓血0.5~1.5毫升;采用Ficoll密度梯度離心法從該骨髓血中
提取單核細胞;使用內皮細胞培養液作為培養液,加入所提單核細胞,并加入20
%的小牛血清;細胞以5×105~7×105cell/mm2的密度種于35毫米fibronectin
包被的培養皿中,經過3天的培養,用PBS將未貼壁的細胞清洗2次并棄去;之
后每3天還培養液一次;共培養2~3周,備用;
(5)平滑肌細胞和成纖維細胞的植入:
在37℃、5%的二氧化碳培養箱中,將步驟(1)所獲得的脫細胞血管支架
固定在一個密閉的博動回路中;取步驟(2)和步驟(3)制備的對數生長期的平
滑肌細胞和成纖維細胞至于含脫細胞血管支架的密閉的博動回路中,種植于脫細
胞血管支架內;置于含20%小牛血清M199培養液的培養箱的博動回路中,于37
℃、5%的二氧化碳培養箱中培養,2~3天更換培養液1次;培養2~4周后,用
γ射線照射嵌入平滑肌細胞和成纖維細胞的臍血管,一分鐘1000rads,共3分鐘,
總照射劑量3000rads;取材一部份進行病理,免疫組織化學和電鏡檢查,備用;
(6)內皮祖細胞的植入:
將步驟(4)制備的含內皮組細胞的培養液置入步驟(5)的博動回路中,
并置于含20%小牛血清的M199培養液的培養皿中,37℃、5%的二氧化碳培養箱
中培養,2~3天換液一次;每次換液時均向培養液中加入肝素和VEGF,使培養
液中肝素濃度為1‰,VEGF濃度為10ng/ml;2~4周后取材一部分,進行病理,
放射免疫和電鏡檢查;倒置顯微鏡顯示內皮祖細胞覆蓋于血管內壁表面形成完整
細胞層。
2.根據權利要求1所述的一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法,其特征
在于,步驟(1)中所述的臍血管為臍動脈或臍靜脈。
3.根據權利要求2所述的一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法,其特征
在于,步驟(1)中所述的臍血管為臍靜脈。
4.根據權利要求1所述的一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法,其特征
在于,步驟(1)所述的離體臍帶為離體10分鐘內置入0~4℃肝素生理鹽水中保
存24小時以內的。
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