本發明公開了一種小口徑組織工程學人工血管，其是以離體的脫細胞臍血管為支架，該支架空隙部分填補有平滑肌細胞和成纖維細胞；所述離體的脫細胞臍血管內壁表面植有內皮祖細胞或間充質干細胞。本發明具有良好的生物相容性，并具有引導、支持和維持細胞功能的能力，減少了種間病毒的相互感染，本發明制成的人工血管克服由于自體血管移植物的提供受限問題以及合成的移植物因血栓形成和/或內膜增生引起的失敗問題，提高了小口徑人工血管植入人體內的長期通暢率，使患者避免了二次手術。本發明人工血管原材料易得，制備方法簡便，成本低廉，易于被普通患者接受，有廣闊的社會效益和經濟效益。

1.一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法，其特征在于，其是由下列
步驟制備而成：
(1)脫細胞臍血管支架的制備：
選擇離體臍帶備用；從該臍帶上截取15cm長的臍血管置于0～4℃肝素生理
鹽水中保存備用；然后將外徑為4～6mm的玻璃棒插入該臍血管管腔內；修剪該
血管外膜，使所述外膜厚度為650μm～800μm；將該臍血管置于0.25％胰蛋白酶
中4℃保存24小時，PBS液沖洗3次，然后置于1％SDS液中24小時；PBS液沖洗
3次后置于青鏈霉素雙抗中12小時；最后再使用PBS沖洗3次備用；
(2)平滑肌細胞的制備：
取離體無菌臍血管于生理鹽水中漂洗至血污清除干凈為止；后用D-Hanks
液沖洗清除血細胞；游離出臍動脈：將一根直徑為2～3mm的玻璃棒插入臍動脈
內腔，清除該游離出的臍動脈外周脂肪組織；然后用0.25％胰蛋白酶溶液消化該
臍動脈血管壁內皮細胞后，剪開血管壁，采用貼壁法接種平滑肌細胞于培養皿中；
當原代細胞生長成致密單層細胞時，傾去瓶中培養液；加入0.25％胰蛋白酶在室
溫作用3分鐘，在倒置顯微鏡下觀察見細胞收縮，邊緣清楚時停止消化；倒去消
化液加入含10％小牛血清培養液，用吸管吹打細胞制成細胞懸液；取二分之一細
胞懸液接種到新的培養瓶中每3天換液1次，當細胞鋪滿瓶壁時用同法進行傳代；
培養至第3～4代，進行HE染色，免疫組織化學檢查和細胞計數，備用；
(3)成纖維細胞的制備：
取離體真皮組織，用經HBSS平衡的Hanks沖洗并切碎；然后在含0.25％胰
蛋白酶的RPMR?1640完全培養基中培養1～12小時；離心，細胞種植培養；培養
過程中首先貼壁的細胞為成纖維細胞，選擇具有典型的成纖維細胞形態的細胞，
加入含10％FBS和100U/mL青霉素、鏈霉素的RPMR?1640的完全培養液中，放
入含5％CO₂、37℃孵箱中培養；12小時后更換培養液，以后每3～4天更換1
次完全培養液，當細胞長成梭形，融合至85％，將細胞用胰蛋白酶消化傳代，備
用；
(4)內皮祖細胞或間充質干細胞的制備：
取離體骨髓血0.5～1.5毫升；采用Ficoll密度梯度離心法從該骨髓血中
提取單核細胞；使用內皮細胞培養液作為培養液，加入所提單核細胞，并加入20
％的小牛血清；細胞以5×10⁵～7×10⁵cell/mm²的密度種于35毫米fibronectin
包被的培養皿中，經過3天的培養，用PBS將未貼壁的細胞清洗2次并棄去；之
后每3天還培養液一次；共培養2～3周，備用；
(5)平滑肌細胞和成纖維細胞的植入：
在37℃、5％的二氧化碳培養箱中，將步驟(1)所獲得的脫細胞血管支架
固定在一個密閉的博動回路中；取步驟(2)和步驟(3)制備的對數生長期的平
滑肌細胞和成纖維細胞至于含脫細胞血管支架的密閉的博動回路中，種植于脫細
胞血管支架內；置于含20％小牛血清M199培養液的培養箱的博動回路中，于37
℃、5％的二氧化碳培養箱中培養，2～3天更換培養液1次；培養2～4周后，用
γ射線照射嵌入平滑肌細胞和成纖維細胞的臍血管，一分鐘1000rads，共3分鐘，
總照射劑量3000rads；取材一部份進行病理，免疫組織化學和電鏡檢查，備用；
(6)內皮祖細胞的植入：
將步驟(4)制備的含內皮組細胞的培養液置入步驟(5)的博動回路中，
并置于含20％小牛血清的M199培養液的培養皿中，37℃、5％的二氧化碳培養箱
中培養，2～3天換液一次；每次換液時均向培養液中加入肝素和VEGF，使培養
液中肝素濃度為1‰，VEGF濃度為10ng/ml；2～4周后取材一部分，進行病理，
放射免疫和電鏡檢查；倒置顯微鏡顯示內皮祖細胞覆蓋于血管內壁表面形成完整
細胞層。
2.根據權利要求1所述的一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法，其特征
在于，步驟(1)中所述的臍血管為臍動脈或臍靜脈。
3.根據權利要求2所述的一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法，其特征
在于，步驟(1)中所述的臍血管為臍靜脈。
4.根據權利要求1所述的一種小口徑組織工程學人工血管的制備方法，其特征
在于，步驟(1)所述的離體臍帶為離體10分鐘內置入0～4℃肝素生理鹽水中保
存24小時以內的。