本發明公開了一種耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的發酵制備及分離純化方法，屬于微生物技術領域。該發酵制備得到葡萄糖氧化酶具有高的耐熱性和耐酸性，解決了在食品及飼料中因高溫及酸性環境中使用導致的酶活力低的缺陷。具體步驟如下：將菌種培養成孢子并將孢子清洗后制備單孢子菌懸液；將單孢子菌懸液接入種子培養基中發酵培養；將種子培養液接入搖瓶發酵培養基中發酵培養，將發酵補充營養液加入發酵液中；糊精、可溶性淀粉及山梨酸鉀加入發酵液中并攪拌均勻，將發酵液冷凍，干燥并粉碎，得葡萄糖氧化酶。發酵得到的葡萄糖氧化酶粗酶液經過熱處理、硫酸銨?乙醇復合沉淀及離子交換層析和分子篩凝膠過濾層析，得到高回收率高純度的葡萄糖氧化酶。

1.一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備及分離純化方法，包括發酵制備方法和分離純化方法，所述發酵制備方法，其特征在于，具體步驟如下：（1）將嗜熱擬青霉菌種在PDA活化培養基平板上劃線活化，并將PDA活化培養基平板置于30～40℃的恒溫培養箱中活化培養48～72h，即得嗜熱擬青霉絲；所述嗜熱擬青霉菌種已于2016年11月11日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC NO.13182；（2）用接種環刮取步驟（1）中所制備的嗜熱擬青霉絲接種于斜面培養基上，并將斜面培養基置于30～40℃的條件下培養2～4d，即得孢子；（3）將步驟（2）中所制備的孢子用含有0.01%（v/v）吐溫80的0.75%無菌生理鹽水清洗孢子，將清洗后的孢子放入盛有50～55mL無菌生理鹽水和無菌玻璃珠的錐形瓶中并充分振蕩30～45min，待孢子充分分散后，制備孢子含量為1.0×10⁸CFU/mL的孢子懸液，即得單孢子菌懸液；（4）將步驟（3）中所制備的單孢子菌懸液以4～8%（v/v）的接種量接入裝有30～50mL種子培養基的三角瓶中，三角瓶在轉速為160～200r/min、溫度為30～45的條件下，搖床培養18～24h，即得嗜熱擬青霉種子培養液；（5）將步驟（4）中所制備的嗜熱擬青霉種子培養液以6～10%（v/v）的接種量接入裝有150～200mL搖瓶發酵培養基的三角瓶中，三角瓶采用6層紗布封口，將封口的三角瓶在轉速為160～200r/min、溫度為40～45℃的條件下搖床發酵30～48h，即得嗜熱擬青霉發酵培養液；（6）將60～100mL的發酵補充營養液加入步驟（5）中所制備的嗜熱擬青霉發酵培養液中，即得發酵液一，待發酵液一溫度降至37～40℃時，調節發酵液一的pH為5～6，并繼續振動發酵，待發酵時間達72h時、溫度降至28～32℃，再次向發酵液一中加入50～80mL的發酵補充營養液，并繼續發酵24～48h，即得發酵液二；（7）將步驟（6）中所制備的發酵液二經4層紗布過濾，得菌絲和濾液，將濾液在轉速為8000r/min的條件下離心20～30min，得沉淀和上清液，將上清液用超濾膜超濾2次，即得截留液，將所得截留液濃縮3～4倍，即得濃縮液，將所得濃縮液在60～70℃條件下旋轉蒸發儀抽真空濃縮，即得粗酶液；（8）將1～2wt%的糊精、2～4wt%的可溶性淀粉和0.1～0.2wt%的山梨酸鉀加入步驟（7）中所制備的粗酶液中，并攪拌均勻，即得葡萄糖氧化酶溶液，將葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷凍6～8h，將冷凍后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35～45Pa、溫度為-35℃的條件下，冷凍干燥15～20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制劑；所述分離純化方法，具體步驟如下：（1）將嗜熱擬青霉發酵培養液在8000r/min的條件下，離心20～30min，棄沉淀保留上清液，將上清液加熱至80℃，保溫20～30min，待上清液冷卻至室溫后放置4℃的條件下靜置6～8h，將靜置后的上清液置于8000r/min的條件下，離心20～30min，去掉沉淀下的雜蛋白；所述嗜熱擬青霉菌種已于2016年11月11日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC NO.13182；（2）向熱處理后的葡萄糖氧化酶粗酶液中加入硫酸銨，至飽和度達到30～40％，并調節其pH為6.5～7.0，在4℃下的條件下，靜置24～28h后，在8000r/min的條件下，離心20～40min，棄沉淀保留上清液，向上清液中加入50～70％的無水乙醇，并調節其pH為5.5～6.0，4℃下靜置24h后，于8000r/min的條件下，冷凍離心20～35min，棄上清液，將沉淀用去離子水溶解，并充分透析脫鹽；（3）透析脫鹽后的酶液，上樣至經Tris-HCl緩沖液平衡的DEAE-Sephadex A-50離子交換柱，上樣后用Tris-HCl緩沖液充分淋洗至A280不發生變化，然后采用含0～0.5mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液以1～1.5mL/min流速進行線性梯度洗脫，每管收集3mL；（4）將上述分離純化的酶液，上樣至經0.05mo1/L pH為6.0磷酸鹽緩沖液平衡的Sephadex G-100凝膠層析柱，采用0.05mol/L pH 6.0 磷酸鹽緩沖液以0.5mL/min流速進行洗脫，每管收集2mL。2.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中PDA活化培養基的成分及配比為土豆浸出液100mL、無機鹽液1mL、蔗糖2g及瓊脂粉1.5g。3.根據權利要求2所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于，所述土豆浸出液的制備方法如下：將土豆削皮切成1cm³小塊，稱取200g土豆小塊放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并過濾，得土豆濾液，將土豆濾液定容到1000mL，即得土豆浸出液。4.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于：所述步驟（2）中斜面培養基為嗜熱擬青霉孢子培養基。5.根據權利要求4所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于：所述嗜熱擬青霉孢子培養基的成分及配比為土豆浸出液50mL、麩皮浸出液50mL、蔗糖1g及瓊脂粉1.5g。6.根據權利要求5所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于，所述麩皮浸出液的制備方法如下：稱取50g麩皮置于容器中，向容器中加入300mL水煮沸30min并過濾，得麩皮濾液，將麩皮濾液定容到200mL，即得麩皮浸出液。7.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟（5）中的搖瓶發酵培養基的成分及配比為PDA浸出液100mL、麩皮浸出液100mL、蔗糖15～20g、豆粕粉10～15g、谷朊粉10～20g、玉米粉5～10g、蛋白胨5～10g、硫酸銨0.5g、硝酸銨2～5g、尿素2～5g、玉米漿20～30mL、吐溫80 2～5mL及復合微量元素1～5mL，并加去離子水至1000mL；所述復合微量元素的成分為MnCl₂?4H₂O 0.1g、CoCl₂0.05g、CuSO₄ 0.02g、MgSO₄ 0.3g、K₂PO₄ 1g、FeSO₄?7H₂O 0.1g、ZnCl₂ 0.03g、LiCl 0.05g、CaCl₂ 0.05g、H₃BO₃ 0.01g及KI 0.5g，并加去離子水1000 mL。8.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于：所述步驟（6）中發酵補充營養液的成分及配比為蔗糖20～50g、豆餅粉20～50g、尿素5g、NH₄NO₃ 5g、補充去離子水至1000mL。9.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉產耐熱耐酸的葡萄糖氧化酶的發酵制備方法，其特征在于：所述步驟（7）中第一次采用截留分子質量為100～120kDa的超濾膜；第二次采用截留分子質量為20～30kDa的超濾膜。