具有高產(chǎn)α-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體及突變方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明改進(jìn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱CGT酶)的產(chǎn)物特異性，提供了提高來(lái)源于Peanibacillus macerans JFB 05-01(CCTCC NO：M 208063)的CGT酶產(chǎn)α-環(huán)糊精能力的突變方案，將CGT酶的372位的Asp替換為L(zhǎng)ys，89位的Tyr分別替換為Asp及Arg，分別獲得單突變體酶D372K，Y89D及Y89R，它們的α-環(huán)糊精生產(chǎn)能力較野生型CGT酶有所提高；將帶有Lys372的CGT酶的基因片段替代Y89R基因的相應(yīng)片段，可獲得雙突變體酶D372K/Y89R，其α-環(huán)糊精產(chǎn)量比野生型CGT酶增加了1.5倍，而β-環(huán)糊精產(chǎn)量降低了57％。這些突變體比野生型CGT酶更利于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)。

1.來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB?05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的單突變體酶D372K的制備方法，其特征是：(1)定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以表達(dá)載體cgt/pET-20b(+)為模板，引入D372K密碼子的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5’-GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC-3’，下劃線為突變堿基，反向引物：5’-GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC-3’，下劃線為突變堿基，PCR反應(yīng)體系為：10×Ex?Taq?buffer?5μL，2.5mM?dNTPs?5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA?1μL，5U/μL?Ex?Taq?HS?0.25μL，加入雙蒸水至50μL；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；隨后進(jìn)行94℃30s，55℃30s，72℃6min?35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn?I消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，突變質(zhì)粒測(cè)序正確；(2)突變體的表達(dá)與純化：挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)8～10h，按4％接種量將種子發(fā)酵液接到含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30℃搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時(shí)后，將發(fā)酵液于4℃、10000rpm離心20min除菌體，收集上清液并純化，得到突變體酶D372K制品。2.來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB?05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的單突變體酶Y89D的制備方法，其特征是：(1)定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以表達(dá)載體cgt/pET-20b(+)為模板，引入Y89D密碼子的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5’-CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA-3’，下劃線為突變堿基，反向引物：5’-TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG-3’，下劃線為突變堿基，PCR反應(yīng)體系為：10×Ex?Taq?buffer?5μL，2.5mM?dNTPs?5μL，10μμM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA?1μL，5U/μL?Ex?Taq?HS?0.25μL，加入雙蒸水至50μL；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；隨后進(jìn)行94℃30s，55℃30s，72℃6min?35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn?I消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，突變質(zhì)粒測(cè)序正確；(2)突變體的表達(dá)與純化：挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)8～10h，按4％接種量將種子發(fā)酵液接到含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30℃搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時(shí)后，將發(fā)酵液于4℃、10000rpm離心20min除菌體，收集上清液并純化，得到突變體酶Y89D制品。3.來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB?05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的單突變體酶Y89R的制備方法，其特征是：(1)定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以表達(dá)載體cgt/pET-20b(+)為模板，引入Y89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5’-CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA-3’，下劃線為突變堿基，反向引物：5’-TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG-3’，下劃線為突變堿基，PCR反應(yīng)體系為：10×Ex?Taq?buffer?5μL，2.5mM?dNTPs?5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA?1μL，5U/μL?Ex?Taq?HS?0.25μL，加入雙蒸水至50μL；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；隨后進(jìn)行94℃30s，55℃30s，72℃6min?35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn?I消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，突變質(zhì)粒測(cè)序正確；(2)突變體的表達(dá)與純化：挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)8～10h，按4％接種量將種子發(fā)酵液接到含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30℃搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時(shí)后，將發(fā)酵液于4℃、10000rpm離心20min除菌體，收集上清液并純化，得到突變體酶Y89R制品。4.來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB?05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的雙突變體酶D372K/Y89R的制備，其特征是：(1)定點(diǎn)突變利用快速PCR技術(shù)，以權(quán)利要求1所述單突變體酶D372K基因?yàn)槟０澹隮89R密碼子的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5’-CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA-3’，下劃線為突變堿基，反向引物：5’-TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG-3’，下劃線為突變堿基，PCR反應(yīng)體系為：10×Ex?Taq?buffer?5μL，2.5mM?dNTPs?5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA?1μL，5U/μL?Ex?Taq?HS?0.25μL，加入雙蒸水至50μL；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；隨后進(jìn)行94℃30s，55℃30s，72℃6min?35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn?I消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，突變質(zhì)粒測(cè)序正確；(2)突變體的表達(dá)與純化：挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)8～10h，按4％接種量將種子發(fā)酵液接到含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30℃搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90小時(shí)后，將發(fā)酵液于4℃、10000rpm離心20min除菌體，收集上清液并純化，得到突變體酶D372K/Y89R制品。