利用卡那霉素抗性基因啟動子表達的重組克雷伯氏菌及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明提供一株提高1，3-丙二醇產量的重組克雷伯氏桿菌，其分類命名為克雷伯氏桿菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M208134。將來自克雷伯氏桿菌1，3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT，構建克雷伯氏桿菌表達載體pETPkan-dhaT；將該表達載體轉入克雷伯氏桿菌中，獲得了重組克雷伯氏桿菌pETPkan-dhaT；加強dhaT基因的表達，得到的重組克雷伯氏菌在以甘油為底物的發酵過程中，中間產物3-羥基丙醛積累量明顯降低，1，3-丙二醇產量比對照提高16.9％；為構建高產1，3-丙二醇或利用葡萄糖為底物產1，3-丙二醇克雷伯氏基因工程菌打下基礎。

1.一株提高1，3-丙二醇產量的重組克雷伯氏桿菌，其分類命名為克雷伯氏
桿菌(Klebsiella?sp.)菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為
CCTCC?NO：M?208134。
2.根據權利要求1所述的重組克雷伯氏桿菌，其特征是構建所用的表達載
體pETPkan-dhaT，采用卡那霉素抗性基因啟動子Pkan。
3.根據權利要求1所述的重組克雷伯氏桿菌，其特征是擴增了來自克雷伯
氏桿菌1，3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT。
4.根據權利要求1所述的重組克雷伯氏桿菌，其特征是達到克雷伯氏桿菌
自身的1，3-丙二醇氧化還原酶加強表達，來提高發酵法生產1，3-丙二醇的產
量。
5.權利要求1所述重組克雷伯氏桿菌的構建方法，其特征是將來自克雷伯
氏桿菌1，3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT，構建克雷伯氏桿菌表達載體
pETPkan-dhaT；將該表達載體pETPkan-dhaT轉入克雷伯氏桿菌中，獲得了重組
克雷伯氏桿菌(Klebsiella?sp.)菌株CCTCC?NO：M?208134；
(1)質粒pETPkan的構建：
以質粒pET28a為模板，進行PCR擴增，所用引物如下：
P1：5’-cgc?aga?tct?GTA?TCT?CAG?TTC?GGT?GTA?GG-3’
P2：5’-cgc?gaa?ttc?AAC?ACC?CCT?TGT?ATT?ACT?G-3’
PCR方法如下：50μL反應體系中加入：10mmol/L的引物P1和P2各1.5μL，
2mmol/L的dNTP?5μL，10×ExTaq?Buffer?5μL，5U/μL的ExTaq?DNA聚合酶0.5μL，
模板1μg，加雙蒸水補齊50μL；PCR條件為：95℃變性5分鐘；94℃變性1分
鐘、54℃1分鐘、72℃延伸2分鐘，循環30次；
通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR
片段回收試劑盒回收0.5kb的目標片段；純化好的目標片段經Bgl?II和EcoR?I
雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pET28a經過BamH?I和EcoR?I雙
酶切，用PCR片段回收試劑盒純化；用T₄連接酶連接兩酶切純化好的片段，連
接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物涂布于含有50μg/mL卡那霉
素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；提取質粒，分別用Bgl?II和EcoR?I雙酶切，
瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，冷
凍保存于-80℃；重組質粒命名為pETPkan，陽性重組子命名為JM109/pETPkan；
(2)質粒pETPkan-CMcds的構建：
以質粒pACYCDuet為模板進行PCR擴增氯霉素編碼結構基因CMcds，所
用引物如下：
P3：5’-cgc?gaa?ttc?Atg?Gag?Aaa?AaaAtc?Act?Gg-3’
P4：5’-cgc?aag?ctt?tta?cgc?ccc?gcc?ctg?cca?ctc-3’
PCR方法如下：50μL反應體系中加入：10mmol/L的引物P3和P4各1.5μL，
2mmol/L的dNTP?5μL，10×ExTaq?Buffer?5μL，5U/μL的ExTaq?DNA聚合酶0.5μL，
模板1μg，加雙蒸水補齊50μL；PCR條件為：95℃變性5分鐘；94℃變性1分
鐘、54℃1分鐘、72℃延伸2分鐘，循環35次；
用試劑盒回收0.7kb的目標片段；純化好的目標片段經EcoR?I和Hind?III
雙酶切，回收；同時提取質粒pETPkan，并用EcoR?I和Hind?III雙酶切，回收
純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，連接產物轉化大腸桿菌JM109感
受態細胞，轉化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB瓊
脂平板，37℃培養過夜；提取質粒，分別用EcoR?I和Hind?III雙酶切，瓊脂糖
凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，冷凍保存
于-80℃；重組質粒命名為pETPkan-CMcds，陽性重組子命名為
JM?109/pETPkan-CMcds；
(3)質粒pETPkan-CMcds轉化克雷伯氏菌：
質粒pETPkan-CMcds用氯化鈣法轉化克雷伯氏菌感受態細胞，轉化物涂布
于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；
發現有大量單菌落生成；
(4)質粒pETPkan-dhaT的構建：
以克雷伯氏菌染色體DNA為模板，進行PCR擴增1，3-丙二醇氧化還原酶
編碼基因dhaT，引物序列如下：
P5：5’-ACCGGAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
P6：5’-ACC?GAAGCTTTC?AGA?ATG?CCT?GGC?G-3’
PCR方法如下：50μL反應體系中加入：10mmol/L的引物P5和P6各1.5μL，
2mmol/L的dNTP?5μL，10×ExTaq?Buffer?5μL，5U/μL的ExTaq?DNA聚合酶0.5μL，
模板1μg，加雙蒸水補齊50μL；PCR條件為：95℃變性5分鐘；94℃變性1分
鐘、54℃1.5分鐘、72℃延伸2分鐘，循環35次；
通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR
片段回收試劑盒回收1.2kb的目標片段；純化好的目標片段經EcoR?I和Hind?III
雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pETPkan經過EcoR?I和Hind?III雙
酶切，用PCR片段回收試劑盒純化；用T₄連接酶連接兩酶切純化好的片段，連
接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物涂布于含有50μg/mL卡那霉
素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；提取質粒，分別用EcoR?I和Hind?III雙酶
切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，
冷凍保存于-80℃；重組質粒命名為pETPkan-dhaT，陽性重組子命名為
JM?109/pETPkan-dhaT；
(5)重組克雷伯氏桿菌CCTCC?NO：M?208134的構建：
取一支冷凍保存的JM109/pETPkan-dhaT，接種于20mL含50μg/mL卡那
霉素的LB培養基中，37℃培養過夜，提取質粒pETPkan-dhaT，用氯化鈣法轉
化克雷伯氏桿菌感受態細胞，轉化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素LB瓊脂平
板，37℃培養過夜；有大量單菌落生成，即為重組克雷伯氏桿菌CCTCC?NO：
M?208134。
6.用權利要求1所述重組克雷伯氏桿菌發酵生產1，3-丙二醇的方法，其
特征是：
出發菌株：重組克雷伯氏桿菌CCTCC?NO：M?208134；
培養基組成：種子培養基以g/L計：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10；
發酵培養基以g/L計：甘油50，酵母膏5，KH₂PO₄?5，(NH₄)₂SO₄?0.1，檸檬
酸4，微量元素溶液60mL，維生素B12的添加量為發酵培養基中維生素B12
終濃度15mg/L，初始pH?7.0；
所述微量元素溶液每升含有：0.68g?ZnCl₂，2.0g?MnCl₂·4H₂O，60mg?H₃BO₃，
0.47g?CoCl₂·6H₂O，5mg?Na₂MoO₄·2H₂O，17g?CuCl₂·2H₂O，5.4g?FeCl₃·6H₂O和質
量濃度37％的HCl?10mL；
培養條件：從新鮮的LB培養基斜面上挑取一環菌株接入裝液量為50mL
的250mL搖瓶中，于旋轉式搖床中37℃、140r/min培養20h得到種子液，
按照5％接種量接入裝液量為50mL發酵培養基的250mL搖瓶中，發酵30h。