本發明涉及一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，利用機械法分離人皮膚干細胞，體外培養人皮膚干細胞，利用人皮膚干細胞體外形成擬胚體的方法進行分化，分化后用骨形態發生蛋白-4、干細胞生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等細胞因子體外誘導14天，可獲得一些能夠表達早期生殖細胞基因的原始生殖細胞樣細胞；之后采用豬的卵泡液進行誘導。本發明方法獲得了與體內正常原始生殖細胞形態和特異分子標記表達原始生殖細胞樣細胞，細胞熒光分析體外誘導得到的原始生殖細胞樣細胞表達Stra8和Dazl，能夠達到早期減數分裂。

1.一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特征在于：按照如下步驟
操作：第一步，將人的皮膚轉移至磷酸鹽緩沖液+10％胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3
次，去掉與皮膚連接在一起的血凝塊和脂肪；在新鮮DMEM/F12中將分離干凈的皮膚洗3次；
第二步，皮膚干細胞的體外培養：皮膚經DMEM/F12洗完后，用剪刀剪碎，再經DMEM/F12洗
3遍；然后置于0.25％Trypsin-0.04％EDTA，37℃消化，輕輕吹打混勻后加入10％血清終止消
化，DMEM/F12中洗3遍，最后用移液槍吹打，直至組織能夠自由進入槍頭，將吹打好的組織
過篩到皮膚干細胞培養液培養；所述皮膚干細胞培養液包含：DMEM/F12、2％B-27、20ng/ml
表皮生長因子、40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、1％青霉素和鏈霉素，以培養當天為零代，
每4天傳代一次；第三步，皮膚干細胞體外形成擬胚體：當皮膚干細胞培養到第二代3-4天
時，離心收集細胞，棄上清，加入0.25％Trypsin室溫消化，然后輕輕吹打至單細胞，終止
消化，Medium199洗兩遍后轉入SARSTEDT懸浮培養24孔板，置于擬胚體培養基中培養，擬
胚體培養液包括：pH7.0的Medium199、3mg/ml牛血清蛋白、1mg/ml胎球蛋白、5μl/ml胰
島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉、0.23mM丙酮酸鈉、1ng/ml表皮生長因子、20ng/ml激活素A和30ng/ml
的骨形態發生蛋白-4；第四步，擬胚體培養3-4天后開始向原始生殖細胞分化：用0.25％
Trypsin消化擬胚體，室溫消化過程中用移液槍吹打至單細胞，用血清終止消化，收集細胞，
離心；棄上清，加入培養液懸浮細胞；之后接種到24孔板中，每個孔接種細胞密度為5×10⁴；
將培養板置于37℃、飽和濕度、5％CO₂中培養14天，培養液包括：DMEM高糖、10％胎牛血清、
0.23mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、2mM?L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巰基乙醇、20ng/ml表
皮生長因子、40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、40ng/ml干細胞生長因子、1μM視磺酸和
30ng/ml骨形態發生蛋白-4；第五步，豬卵泡液繼續培養：將24孔板的細胞消化下來，接種
到用多聚賴氨酸處理過的6cm培養皿里，每個培養皿的接種密度為1×10⁴，換成豬卵泡培養
液進行培養；豬卵泡培養液包括：DMEM高糖、5％豬卵泡液、5％胎牛血清、0.23mM丙酮酸鈉、
0.1mM非必需氨基酸、2mM?L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巰基乙醇。
2.根據權利要求1所述的一種人皮膚干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特
征在于：細胞熒光分析體外誘導得到的原始生殖細胞樣細胞表達Stra8和Dazl，達到早期減
數分裂。