本發(fā)明涉及一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法，屬于生物檢驗檢疫領(lǐng)域。抗卵白蛋白的單克隆抗體的制備，抗卵白蛋白的多克隆抗體的制備，包被抗體用特異性高的單克隆抗體，檢測抗體用HRP標(biāo)記的多克隆抗體，檢測程序簡單方便，檢測時間短，且靈敏度高，最低檢測限可達(dá)到0.31ng/mL，用于制備快速、有效、低成本的過敏原檢測試劑盒，操作簡單方便，一次操作時間不超過2h，且可同時檢測多個樣品，節(jié)省時間，檢測靈敏度高。

1.一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法，其特征在于包括下列步驟：（一）抗卵白蛋白的單克隆抗體制備：（a）采用足墊快速免疫方案免疫健康?BALB/C?雌性小鼠：用1mg/mL的卵白蛋白100μL與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的卵白蛋白?100μL與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；（b）細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆:強(qiáng)免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出腘淋巴結(jié)，用注射器研磨腘淋巴結(jié)制備細(xì)胞懸液，按1：5～10的比例與SP2/0細(xì)胞充分混合，在37℃水浴下與50%PEG1000進(jìn)行細(xì)胞融合；將融合后的細(xì)胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細(xì)胞生長狀況補(bǔ)加或更換HAT培養(yǎng)基；待克隆細(xì)胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，并選擇陽性高、細(xì)胞生長狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽性為止；先后兩次細(xì)胞融合的融合率分別為20.3%和73.1%，陽性率分別為0和1.78%，經(jīng)過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC?No.5557，分類命名：產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細(xì)胞株；親和力常數(shù)為4.8×10⁸M^-1；（二）制備抗卵白蛋白的多克隆抗體：（a）用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西蘭大白兔，免疫劑量為1mg/1mL/只，第一次免疫用弗式完全佐劑與等體積的卵白蛋白OVA乳化完全后于頸部及背部皮下結(jié)合后腿根部肌肉多點注射，以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑，免疫劑量及免疫方法同第一次免疫，第三次加強(qiáng)免疫后10天耳緣靜脈采血并分離血清，用雙向免疫瓊脂擴(kuò)散方法測定血清效價，當(dāng)血清效價達(dá)到2⁴及以上時，心臟采血并在37℃放置2h，4℃靜置過夜后3000rpm離心20min，收集血清，即獲得多克隆抗體；（b）多克隆抗體的純化采用辛酸-硫酸銨法純化兔血清，具體操作如下：（1）1份血清加入3份pH?4.5的醋酸鹽緩沖液，混合均勻后于30min內(nèi)逐滴加入正辛酸，邊加邊攪拌，加入辛酸的量為75ul/mL兔血清，4℃靜置1h；（2）4℃以12000rpm離心30min，棄沉淀收集上清并準(zhǔn)確記錄體積，加入1/10倍體積、0.01M的?pH7.0PBS，調(diào)pH至7.2,然后逐滴加入飽和硫酸銨至50%飽和，邊加邊攪拌，4℃靜置2h；(3)?4℃,12000rpm離心15min,棄上清，沉淀用適當(dāng)體積0.01M的?pH7.0的PBS溶起，逐滴加入飽和硫酸銨至33%飽和,4℃靜置2h；（4）重復(fù)第3步；5）4℃,12000rpm離心15min,棄上清，沉淀用適當(dāng)體積0.01M的pH7.0的PBS溶起，并于4℃條件下在0.01M?的pH7.0的PBS中透析直到?jīng)]有硫酸根離子為止；紫外分光光度計測定純化后的蛋白濃度，并分裝保存至-80℃?zhèn)溆茫?c)辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記多克隆抗體純化后的多克隆抗體用一種活化的辣根過氧化物酶試劑盒標(biāo)記，標(biāo)記方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，具體操作方法如下：（1）1mg?HRP用50μL去離子水完全溶解后，加入50μL純化后的多克隆抗體溶液，含有多克隆抗體100μg，混合均勻后加入10μL左右的啟動劑，調(diào)pH至9.5；（2）4℃放置12h，加入少量的硼氫化鈉，再加入終止劑，約3倍體積啟動劑的量，調(diào)節(jié)pH至7.0左右；（3）加甘油至50%，-20℃保存?zhèn)溆茫?d)卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法（1）用純化后的單克隆抗體4E9以5μg/mL包被ELISA板，100?μL/孔，4℃包被過夜；（2）0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；（3）加入新鮮配制的1%脫脂奶粉，100?μL/孔，37℃包被1h；（4）0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；（5）加入系列稀釋的OVA標(biāo)準(zhǔn)品溶液或者待檢樣品及以1：2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體，各100μL/孔，37℃孵育1h；（6）0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；（7）加入OPD底物溶液，100μL/孔，37℃避光反應(yīng)15min；（8）加入2M硫酸終止反應(yīng)，50μL/孔；（9）酶標(biāo)儀492nm處讀值，記錄OD值；（10）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢樣品中OVA含量。