本發明提供一種基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬酶制備方法及應用，首先采用尿素使牛血清白蛋白變性，然后采用1,4?二巰基蘇糖醇還原剪切牛血清白蛋白得到含巰基的鏈狀牛血清白蛋白，通過與氯化血紅素交聯制得含巰基的鏈狀牛血清白蛋白?氯化血紅素骨架復合物，進而將其作為穩定劑和還原劑合成納米金簇，并得到基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬酶，具有廉價、催化活性高、穩定好等優點，解決了血紅素本身催化活性低、不溶于水、水溶液中易團聚、以及在氧化媒介中結構易被破壞等缺點,擴大了血紅素的應用范圍。可用于常見食品中HO含量的快速、高靈敏的檢測，檢測過程不涉及復雜光電儀器使用，簡單易操作，可望在生物催化領域得到廣泛的應用。

1.一種基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬酶制備方法，其特征在于，步驟為：
1）室溫下，將牛血清白蛋白、尿素、EDTA和水混合，攪拌20 min，得濃度分別為7-10 mg/
mL牛血清白蛋白、5-8 M尿素和1.8-3.2 mMEDTA的混合液，隨后向混合液中加入1,4-二巰基
蘇糖醇至濃度為0.08-0.2 mM，然后在氮氣保護下繼續攪拌30min，再用去離子水透析10-
14h，得含巰基的鏈狀牛血清白蛋白液，備用；
2）室溫下，將1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、氯化
血紅素和水混合，得濃度分別為90-120 mM 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、
70-100 mM N-羥基琥珀酰亞胺和1.5-3.0 mg/mL 氯化血紅素的混合液，20-25℃攪拌活化
1h，然后按照混合液與含巰基的鏈狀牛血清白蛋白溶液體積比1：10加入步驟1）制備的含巰
基的鏈狀牛血清白蛋白溶液，在35-40℃下攪拌1-3h，再用去離子水透析10-14h，得含巰基
的鏈狀牛血清白蛋白-氯化血紅素溶液；
3）將步驟2）制備的含巰基的鏈狀牛血清白蛋白-氯化血紅素溶液與8-12 mM的四氯金
酸水溶液按照體積比10:1混合，攪拌10 min，然后加入1.0 M 的NaOH 水溶液調節混合溶液
pH值為10-12，并在37℃下繼續攪拌8-10h，再用去離子水透析10-14h，得基于血紅素和納米
金簇的蛋白模擬酶。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）中，所述的牛血清白蛋白、尿
素、EDTA與1,4-二巰基蘇糖醇的濃度依次為8.0 mg/mL，6 M ，2.0 mM，0.10 mM。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟2）中，所述的1-（3-二甲氨基丙
基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺與氯化血紅素的濃度依次為100 mM，80
mM， 2.0 mg/mL；加入步驟1）制備的含巰基的鏈狀牛血清白蛋白溶液后，攪拌溫度為37℃，
攪拌時間為2h。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟3）中，所述的四氯金酸水溶液為
10 mM；所述的調節混合溶液pH值為12；所述的37℃下繼續攪拌時間為8 h。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）、2）、3）中，所述去離子水透析
時間為12h；所述室溫為20-25℃；所述的溶液如無特別說明，均為水配；所述的透析采用規
格為14 KDa的透析袋。
6.根據權利要求 1-5 任一項 制備得到的基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬酶的應
用，其特征在于：用于食品中H₂O₂含量的速測，測試方法為比色法或電分析法。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的比色法方法為：
1）建立標準曲線：室溫條件下, 將上述制備得到的基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬
酶配制為10 μL 2.0 μg/mL的水溶液，然后加入到200μL含0.69 mM TMB的檸檬酸緩沖溶液
中，然后分別加濃度梯度范圍為0.0030 - 0.21 mM的H₂O₂，靜置20 min，在波長652nm下分別
測定吸光度值，建立濃度-吸光度標準曲線，得標準曲線方程；
2）待測樣品檢測：將待測樣品預處理得稀釋液，將基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬
酶配制為2.0 μg/mL的水溶液，滴入到稀釋液中進行顯色反應，在波長652nm下測定吸光度
值，然后結合濃度-吸光度標準曲線及標準曲線方程計算所含過氧化物濃度；
步驟1）中所述檸檬酸緩沖溶液，pH 為7.40，濃度為0.1M。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的電分析法方法為：
1）建立標準曲線：向濃度為1.0 mM的基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬酶水溶液中加
入0.5wt%的殼聚糖，混合均勻配制為電極修飾液，取5μL電極修飾液滴加到已清洗干凈的玻
碳電極表面，室溫下干燥成膜，得修飾電極；然后用pH 7.4的 PBS緩沖溶液，配制一系列濃
度梯度的H₂O₂-PBS溶液，H₂O₂濃度范圍在0.0020 -0.22 mM，采用線性掃描的方法，用修飾電
極分別測定不同濃度H₂O₂-PBS溶液的響應電流，建立濃度-響應電流標準曲線，得標準曲線
方程；
2）待測樣品檢測：將待測樣品預處理得稀釋液，然后取0.1mL稀釋液與5 mL pH 7.4的
PBS緩沖溶液混合，得待測樣品-PBS溶液；將基于血紅素和納米金簇的蛋白模擬酶配制為
2.0 μg/mL的水溶液，取5μL滴加到已清洗干凈的玻碳電極表面，室溫下干燥成膜，得修飾電
極；采用線性掃描的方法，用修飾電極測定待測樣品-PBS溶液的響應電流，然后結合濃度-
響應電流標準曲線及標準曲線方程計算所含過氧化物濃度。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于：步驟2）待測樣品檢測所述的待測樣品：
若為固體樣品，清水浸泡前需超聲細胞粉碎 ，在3倍體積的清水中浸泡24-28h，取浸泡上清
液用清水稀釋2-8倍，得稀釋液；若為液體樣品，則直接用清水稀釋2-8倍，得稀釋液。