1.一種采用敲除技術建立低磷性佝僂病模型的方法，其特征在于：
①sgRNA表達載體的構建：在PHEX基因第1個外顯子處設計2個sgRNA序列作用靶點，合
成兩對寡聚核苷酸鏈制備sgRNA，其中兩對寡聚核苷酸為：
sgRNA1:TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG和AAACCCAGAGGCACTCGAATTG；
sgRNA2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC和AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG；
合成的寡聚核苷酸分別經退火，退火條件是：95℃ 5min后自然降至室溫，分別用BbsⅠ
限制性核酸內切酶對PUC57載體線性化，隨后將酶切產物進行回收，并將sgRNA1和sgRNA2分
別連接到PUC57載體上，進而完成PUC57-sgRNA1和PUC57-sgRNA2載體的構建；
其中：酶切體系：質粒PUC57 20μl
10×buffer 20μl
BbsⅠ 1μl
ddH2O 159μl
酶切37℃ 3h，電泳跑膠后，使用普通DNA瓊脂糖膠回收試劑盒進行回收；
②CAS9mRNA的合成：CAS9表達質粒經酶切線性化，經酚氯仿抽提純化后，溶于無核酸酶
的水中；
酶切體系：NotⅠ 4μl
CAS9 50μl
BSA 30μl
Triton 30μl
10×H 30μl
ddH2O 156μl
酶切37℃ 3h，電泳跑膠后，使用普通DNA瓊脂糖膠回收試劑盒進行回收；
③受精卵的獲取和顯微注射：注射卵泡刺激素，之后注射人絨毛膜促性腺激素，獲取受
精卵，通過顯微注射儀器將預混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到細胞質中，其中CAS9mRNA
濃度為150ng/μl，sgRNA濃度為30ng/μl；
④受精卵的培養和發育：將顯微注射的受精卵轉移到培養液中，置于37℃恒溫培養箱
中培養，發育到桑椹胚時期時，用吸卵針將單個胚胎轉移到離心管中。
2.根據權利要求1所述的采用敲除技術建立低磷性佝僂病模型的方法，其特征在于：
sgRNA的寡聚核苷酸鏈選取原則：選取分數最高并堿基序列開頭為GG的寡聚核苷酸鏈。
3.權利要求1所述的采用敲除技術建立低磷性佝僂病模型的方法，其特征在于：還包括
胚胎PHEX基因敲除情況鑒定方法：
①胚胎裂解：胚胎裂解試劑為NP40，裂解條件為：56℃ ，1h；95℃，10min；
②DNA測序鑒定胚胎基因型敲除情況：提取DNA，進行PCR，電泳鑒定，并進行DNA測序，得
到基因型鑒定結果；
a、設計PCR引物如下：
上游引物：GTCAACGCTTAACAGACTC
下游引物：CACCTCCAACCACTTAATAC；
b、PCR反應體系如下：
模板DNA 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2×Taq plus 12.5ul
ddH2O 9.5ul；
c、PCR反應條件：
95℃預變性7min；94 ℃變性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；30個循環；72 ℃延伸
5min；
③PCR產物進行測序，測序結果在PHEX基因引物設計的打靶位點附近出現雙峰的情況，
選擇雙峰的樣品再次PCR，產物膠回收后進行連接PGM-T載體，轉化后挑取陽性克隆再次進
行測序，測序結果中在PHEX基因靶位點附近發生堿基插入或堿基缺失，導致閱讀框移碼突
變,則為基因敲除。
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