本發明涉及一種快速檢測茶氨酸合成酶活性的檢測方法，包括：培養液的制備、檢測材料的準備、超高效液相色譜?串聯質譜檢測、酶活性的分析四個步驟。在培養液中加入N標記的茶氨酸合成底物(N標記的鹽酸乙胺)，通過超高效液相色譜?串聯質譜檢測反應產物中合成的茶氨酸含量，運用其中N?茶氨酸與N?茶氨酸的比例，來區分培養過程中合成的茶氨酸，以分析茶氨酸合成酶活性。本發明針對性強，方法簡單，準確性強，靈敏度高，能夠準確檢測到茶氨酸合成酶反應產物；操作方便，檢測方法精確，避免了以前茶氨酸合成酶檢測過程中，其提取的粗酶液中含有的高含量茶氨酸本底，在酶活性較低，產物較少的情況下無法檢測到酶活性。

1.一種快速檢測茶氨酸合成酶活性的檢測方法，其特征在于包括以下操作步驟：
(1)培養液的制備
(1-1)培養液的制備
按照體積比為4:1的比例將30mmol/L KH₂PO₄溶液和30mmol/L K₂HPO₄溶液
混合，調節混合溶液pH至5.6，得到K-Pi緩沖液，備用；
配制200mmol/L的蔗糖溶液，備用；
將K-Pi緩沖液和200mmol/L的蔗糖溶液按體積比19:1的比例混勻后滅菌，冷
卻后取4ml加入40mg抗壞血酸鈉鹽，得到溶液A；
(1-2)穩定性同位素培養液的制備
在(1-1)步中制備的溶液A中加入300mmol/L ¹⁵N標記的鹽酸乙胺；
(2)檢測材料的準備
(2-1)植物材料的處理
取茶樹組織，用70％酒精快速消毒，蒸餾水洗凈，濾紙吸干，稱重后切成約
2mm×2mm的塊狀，在無菌操作臺中，將已切成塊狀的茶樹組織加入培養液
中，28℃在搖床中培養12h，轉速160rpm；
(2-2)培養后材料的處理
終止培養，取出培養液中的茶樹材料，用蒸餾水沖洗吸干，加入液氮，快速
研磨成粉末狀，轉移至離心管中，在-20℃下冷凍4h，再在冷凍干燥機中冷凍至
足干，并留取其培養液待測；
(2-3)材料中茶氨酸的提取
取凍干后的粉末，轉移至10ml離心管中，加入3ml沸水，100℃水浴20min
后離心分離15min取上清液，重復兩次，定容至10ml；
將提取液和留取的培養液通過水相濾頭過濾待測；
(3)材料中茶氨酸的超高效液相色譜–串聯質譜分析
(3-1)標準曲線的制備
利用茶氨酸標品配制濃度分別為0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.01
mg/mL，0.001mg/mL，0.0001mg/mL，0.000001mg/mL的茶氨酸標準樣品，將
上述不同濃度的茶氨酸標準樣品進行LC-MS/MS分析，以茶氨酸濃度為橫坐
標，以茶氨酸離子相對吸收峰值為縱坐標，求得標準曲線；
(3-2)將培養12h后的茶樹組織提取液和培養液進行LC-MS/MS分析，根據標
準曲線計算培養12h后的茶樹組織提取液和培養液中總茶氨酸的含量，¹⁴N-茶氨
酸的含量，¹⁵N-茶氨酸的含量，計算茶氨酸合成酶活力。