本發明提供一種基于RT?qPCR法檢測胃癌的試劑盒及其制備方法，屬于分子生物學技術領域。所述試劑盒采用兩個通用逆轉錄通用引物、一個通用qPCR反向通用引物和兩個通用探針進行所有檢測人類胃癌特異表達的miRNA的反應。實驗證明，所述試劑盒具有檢測特異性非常高：不僅能區別miRNAs和Pre?miRNA、能區別miRNAs和genomic DNA，還能區別同一miRNA家族的不同成員，此外還能能區別miRNAs和其它RNAs。與傳統qPCR相比，本發明使用通用逆轉錄通用引物，通用探針和通用qPCR反向通用引物實現所有人類胃癌特異表達的miRNA的檢測，所述試劑盒具有檢測范圍廣，檢測靈敏度高的特點。

1.一種基于RT-qPCR法檢測胃癌的試劑盒，包括PCR板、qPCR正向引物、qPCR反向通用引
物、探針、逆轉錄通用引物和內參miRNA，其特征在于，所述qPCR正向引物、qPCR反向通用引
物和探針同時包被在PCR板中，所述逆轉錄通用引物盛裝在引物試劑管中；
所述內參miRNA包括ArtRNA3；所述ArtRNA3具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸
序列；
所述逆轉錄通用引物包括兩種；一種逆轉錄通用引物是摩爾濃度為10μmol/L的檢測胃
癌樣品用逆轉錄通用引物，另一種逆轉錄通用引物是摩爾濃度為10μmol/L檢測健康組織樣
品用逆轉錄通用引物；所述檢測胃癌樣品用逆轉錄通用引物具有如序列表中SEQ ID No.2
所示的核苷酸序列；所述檢測健康組織樣品用逆轉錄通用引物具有如序列表中SEQ ID
No.3所示的核苷酸序列；
所述探針包括兩種探針，分別為摩爾濃度為10μmol/L的檢測胃癌樣品用通用探針和摩
爾濃度為10μmol/L的檢測健康組織樣品用通用探針；所述檢測胃癌樣品用通用探針具有如
序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述檢測健康組織樣品用通用探針具有如序列
表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
所述qPCR反向通用引物具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述qPCR正向引物的核苷酸序列同差異表達miRNA的核苷酸序列；所述差異表達miRNA
包括URS000054A671_9606Homo sapiens hsa-miR-5004-5p、TJU_CMC_MD2.ID01366.5p-
miR、TJU_CMC_MD2.ID00936.5p-miR、novel-miR-1373-3p和TJU_CMC_MD2.ID00928.5p-miR
中的一個或多個。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述兩種探針采用兩種不同的染料標
記，分別為FAM熒光探針和VIC熒光探針。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述組分還包括5×聚腺苷酸聚合酶、
10mmol/L ATP溶液、25mmol/L MnCl₂溶液、10×反轉錄緩沖液、100mmol/L dNTP溶液、核酸
酶阻斷劑、2×Taq聚合酶、50×qPCR緩沖液。
4.權利要求1～3任意一項所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括包被PCR板的制
備方法和逆轉錄通用引物試劑管的制備方法；
所述包被PCR板的制備方法包括以下步驟：
1)將qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、檢測胃癌樣品用探針和檢測健康組織樣品用
探針用稀釋液分別稀釋成濃度為10、100和100μmol/L的母液；
2)將1600μL的10μmol/LqPCR反向通用引物溶液、400μL的10μmol/L檢測胃癌樣品用探
針溶液，400μL的10μmol/L檢測健康組織樣品用探針溶液和181.6mL超純水混合，得到總體
積為184mL的混合液；
3)向96深孔板的每孔中加入160μL qPCR正向引物和所述步驟2)得到的混合液1840μl，
混合，得到2000μL的反應體系；
4)將96深孔板分裝到96孔PCR板中，每孔5μL；
5)在陽性對照孔中加入內參miRNA至PCR板中；在陰性對照孔中加入超純水至PCR板中；
6)將所述PCR板進行真空干燥，在25～27℃條件下干燥18～24h，得到包被的PCR板；
所述逆轉錄通用引物試劑的制備方法，包括以下步驟：
A.將逆轉錄通用引物用稀釋液稀釋成10μmol/L的母液；
B.將所述步驟A的母液進行分裝，分裝體積為10μL；
C.將分裝母液置于真空干燥環境中，25～27℃條件下干燥18～24h，得到干燥的逆轉錄
通用引物。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)和步驟A中的稀釋液為TE
緩沖液；所述TE緩沖液包括以下含量的組分：10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA；所述TE緩沖
液的pH值為8.0。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，得到包被PCR板和逆轉錄通用引物后
還包括：將所述制備得到的包被PCR板和逆轉錄通用引物分別真空包裝后裝入自封袋中。