1.一種用于非疾病診斷治療目的的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，包括以下步
驟：
A、利用EGFR特異性引物，對待測序樣本中的目標區域進行擴增，得擴增產物；用于擴增
每個目標區域的EGFR特異性引物中至少有一種PCR引物上含有可斷裂位點或可切除序列，
所述可斷裂位點為U，所述可切除序列為RNA序列；
B、將擴增產物加至切割-連接反應體系中進行切割和連接，從而在擴增產物兩端分別
接上接頭一和接頭二，得文庫分子；
所述切割-連接反應體系包括：連接酶、斷裂劑、接頭一、接頭二和連接緩沖液；所述斷
裂劑為USER酶或RNase H，用于對擴增產物中的可斷裂位點或可切除序列進行特異性切割，
形成第一粘性末端；所述可斷裂位點或可切除序列在PCR引物對中所處位置在與待測序樣
本互補配對區域的5’端，與待測序樣本不互補配對；所述接頭一含有與第一粘性末端完全
互補配對的第二粘性末端；所述接頭二用于與所述第一粘性末端所在端的相對端連接，所
述接頭二為平末端接頭或突出末端接頭；
C、單分子擴增含接頭一和接頭二的文庫分子，得單分子擴增產物；
D、對單分子擴增產物進行高通量測序，得目標區域的序列信息。
2.根據權利要求1所述的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，每個目標區域的EGFR特
異性引物中至少有兩種PCR引物上含有可斷裂位點或可切除序列，且由這些可斷裂位點或
可切除序列所形成的第一粘性末端之間不能互補配對。
3.根據權利要求1所述的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，步驟A中PCR擴增使用的
聚合酶為Taq酶；所述接頭二的一端為單堿基突出末端；所述單堿基突出末端為T，其位于所
在鏈的3’端。
4.根據權利要求1所述的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，所述待測序樣本有多
個，根據待測序樣本的不同分別進行步驟A、B和C；所述接頭一和/或接頭二上含有標簽序
列；所述標簽序列，用于區分待測序樣本。
5.根據權利要求3所述的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，所述接頭一為雙鏈核酸
分子，所述第二粘性末端所在鏈的5’末端含生物素標記；或所述接頭二為雙鏈核酸分子，所
述單堿基突出末端所在鏈的5’末端含生物素標記。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，所述接頭
一或接頭二通過其上的生物素標記被預先固定在含鏈霉親和素或親和素的固相載體上，且
步驟B是在周期性震動中進行的。
7.根據權利要求1所述的EGFR基因突變檢測方法，其特征在于，所述目標區域有4個，分
別位于EGFR基因的Exon18、Exon19、Exon20、Exon21中；所述4個目標區域對應的所述EGFR特
異性引物分別為SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4，SEQ ID NO:5-6，SEQ ID NO:7-8。
8.一種EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括EGFR特異性引物、斷裂劑、接頭一、
接頭二、連接酶和連接酶緩沖液；所述EGFR特異性引物，用于特異性擴增待測序樣本中的目
標區域，且用于擴增每個目標區域的EGFR特異性引物中至少有一種PCR引物上含有可斷裂
位點或可切除序列，所述可斷裂位點為U，所述可切除序列為RNA序列；
所述斷裂劑為USER酶或RNase H，用于對擴增產物中的可斷裂位點或可切除序列進行
特異性切割，形成第一粘性末端；所述可斷裂位點或可切除序列在PCR引物對中所處位置在
與待測序樣本互補配對區域的5’端，與待測序樣本不互補配對；
所述接頭一含有與第一粘性末端完全互補配對的第二粘性末端；所述接頭二用于與所
述第一粘性末端所在端的相對端連接，所述接頭二為平末端接頭或突出末端接頭。
9.根據權利要求8所述的EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述接頭二的一端為
單堿基突出末端；所述單堿基突出末端為T，其位于所在鏈的3’端。
10.根據權利要求9所述的EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述接頭一為雙鏈
核酸分子，所述第二粘性末端所在鏈的5’末端含生物素標記；或所述接頭二為雙鏈核酸分
子，所述單堿基突出末端所在鏈的5’末端含生物素標記。
11.根據權利要求8所述的EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述EGFR特異性引
物包括SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4、SEQ ID NO:5-6和SEQ ID NO:7-8中的至少一對。
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