本發明公開了多重PCR檢測方法及試劑盒。本發明所提供的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：（1）根據靶標基因序列，分別設計上游引物、下游引物、共同引物和探針序列；（2）配置多重PCR反應體系；（3）進行PCR擴增，在PCR擴增周期結束后，進行熔解曲線分析。本發明在PCR擴增過程中針對每一擴增子引入特異性外源核酸序列標簽，在擴增過程中與之后采用完全互補與有限錯配的單標記熒光寡聚合核苷酸探針熒光雜交與熔解分析實現多重檢測。本發明所提供的多重PCR檢測方法，有效地提高了實時熒光定量PCR的檢測重數、檢測通量，并縮短檢測時間。

1.一種多重PCR檢測方法，包括以下步驟：
(1)根據靶標基因序列，分別設計每種所述靶標基因的上游引物、下游引物、共同引物
和探針序列：
所述上游引物與靶標基因序列的上游序列相同；
所述下游引物由3'端特異結合區、外源標簽序列區和下游共同引物區三部分組成；所述
3'端特異結合區與靶標基因序列特異雜交；所述外源標簽序列區與所述探針序列完全互補或
含有限數目核苷酸錯配；每種所述靶標基因的下游引物中的下游共同引物區序列相同，并與
所述共同引物序列相同；
所述共同引物的3'端標記熒光素；
所述探針序列與目的基因序列無顯著同源性，且3'端標記熒光素；
(2)配置多重PCR反應體系，所述多重PCR反應體系包括：Taq?DNA聚合酶、PCR緩
沖液、Mg²⁺、dNTP、每種所述靶標基因的探針、每種所述靶標基因的上游引物和下游引物和
所述共同引物，其中，每種所述靶標基因的上游引物與下游引物濃度相同，所述共同引物濃
度為每種所述靶標基因的上游引物或下游引物濃度的10-20倍；
(3)進行PCR擴增，在PCR擴增周期結束后，進行熔解曲線分析；當探針與外源標簽
序列完全匹配時，Tm值最高；Tm值隨著探針與外源標簽序列的錯配數目增多而降低；
所述外源標簽序列對應于特異的靶標基因序列；
所述共同引物的3'端標記熒光素為熒光素供者，所述探針的3'端標記熒光素為熒光素受
者，所述熒光素供者與所述熒光素受者在相距小于3個堿基距離時發生能量共振轉移。
2.根據權利要求1所述的多重PCR檢測方法，其特征在于：所述外源標簽序列區與所
述探針序列含有限數目核苷酸錯配為所述外源標簽序列區與所述探針序列有1-3個堿基錯配。
3.根據權利要求1或2所述的多重PCR檢測方法，其特征在于：所述探針序列的長度
為15-35個核苷酸堿基，Tm值為55℃-75℃。
4.根據權利要求3所述的多重PCR檢測方法，其特征在于：所述上游引物的長度為15-30
個核苷酸堿基；所述下游引物長度為45-80個核苷酸堿基。
5.一種用于檢測人肌動蛋白的多重PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含以下序
列：
上游引物序列BA1FP：序列表中序列1；
下游引物序列BA1RP：序列表中序列2；
上游引物序列BA2FP：序列表中序列3；
下游引物序列BA2RP：序列表中序列4；
上游引物序列BA3FP：序列表中序列5；
下游引物序列BA3RP：序列表中序列6；
通用引物序列：序列表中序列7；
探針序列：序列表中序列8。