本發明涉及生物領域，特別涉及核酸的檢測技術，具體為microRNA的測序方法，根據靶位點設計待測microRNA的特異性的擴增引物和待測microRNA的焦磷酸測序引物，所述擴增引物的其中一條引物被生物素標記；提取待測樣本的DNA，用設計的所述擴增引物進行PCR擴增反應，得擴增引物，其中，所述特異性擴增引物中的任一條用生物素標記；將所得PCR擴增物采用堿變性分開成單鏈，取其中生物素標記單鏈PCR擴增產物純化后，與所述測序引物進行雜交反應，并分析結果;本發明所選取的microRNA靶序列，以及應用本發明的試劑盒能夠實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測microRNA基因型，能夠滿足臨床檢驗實際工作的需要，利于microRNA基因檢測預測疾病的發生、發展風險。

1.microRNA的測序方法，所述測序方法為非疾病診斷和治療目的的方法，其特征在于，
所述測序方法為焦磷酸測序法，結合二重PCR擴增技術，具體包括以下步驟：
A特異性引物的設計
根據靶位點設計待測microRNA的特異性的擴增引物和待測microRNA的焦磷酸測序引
物，所述擴增引物的其中一條引物被生物素標記；在步驟A中，所述測序引物具體為：has-
miR-146ars2910164的測序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示:has-miR-
149rs2293832的測序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:18所示；has-miR-196a-2rs11614913
的測序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；has-miR-492rs2289030的測序引物的核苷
酸序列如SEQIDNO:20所示；has-miR-544brs10934682的測序引物的核苷酸序列如SEQ
IDNO:21所示；has-miR-604rs2368392的測序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:22所示；
has-miR-605rs2043556的測序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:23所示；has-miR-
608rs4919510的測序引物的核苷酸序列如SEQIDNO:24所示；
BPCR反應
提取待測樣本的DNA，用步驟A涉及的所述擴增引物進行PCR擴增反應，得擴增物，其中，
所述擴增引物中的一條用生物素標記；
C焦磷酸測序
將步驟B所得PCR擴增物采用堿變性分開成單鏈，取其中生物素標記單鏈PCR擴增產物
純化后，與步驟A所述測序引物進行雜交反應，并分析結果；
在步驟A中，所述擴增引物具體為：has-miR-146ars2910164位點的特異性引物：其上
游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示；has-miR-149rs2293832位點的
特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:3所示，下游引物如SEQIDNO:4所示；has-miR-
196a-2rs11614913位點的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:5所示，下游引物如SEQID
NO:6所示；has-miR-492rs2289030位點的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:7所示，下
游引物如SEQIDNO:8所示；has-miR-544brs10934682位點的特異性引物：其上游引物如
SEQIDNO:9所示，下游引物如SEQIDNO:10所示；has-miR-604rs2368392位點的特異性引
物：其上游引物如SEQIDNO:11所示，下游引物如SEQIDNO:12所示；has-miR-
605rs2043556位點的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:13所示，下游引物如SEQID
NO:14所示；has-miR-608rs4919510位點的特異性引物：其上游引物如SEQIDNO:15所示，
下游引物如SEQIDNO:16所示；
所述靶位點包括has-miR-146ars2910164、has-miR-149rs2293832、has-miR-196a-
2rs11614913、has-miR-492rs2289030、has-miR-544brs10934682、has-miR-
604rs2368392、has-miR-605rs2043556和has-miR-608rs4919510位點；
在步驟B中，has-miR-146ars2910164和has-miR-608rs4919510進行二重PCR，和/或
has-miR-149rs2293832和has-miR-605rs2043556進行二重PCR，和/或has-miR-196a-
2rs11614913和has-miR-604rs2368392進行二重PCR，和/或has-miR-492rs2289030和has-
miR-544brs10934682進行二重PCR。
2.根據權利要求1所述的microRNA的測序方法，其特征在于：在步驟B中，has-miR-146a
rs2910164和has-miR-608rs4919510進行二重PCR的退火溫度為62℃；has-miR-
149rs2293832和has-miR-605rs2043556進行二重PCR的退火溫度為55℃；has-miR-196a-
2rs11614913和has-miR-604rs2368392進行二重PCR的退火溫度為52℃；has-miR-
492rs2289030和has-miR-544brs10934682進行二重PCR的退火溫度為58℃。