一種結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變的檢測方法及試劑盒。涉及結核分枝桿菌耐藥突變的檢測技術，提供一種設計簡單，可簡化操作、提高分析靈敏度、成本低廉的結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變的檢測方法及試劑盒。提取結核分枝桿菌樣本的DNA；根據結核分枝桿菌embB基因序列，利用引物設計軟件PrimerPremier 5設計引物和探針；構建PCR反應體系，進行PCR檢測；進行熔解曲線分析及檢測結果判斷：通過分析熔解曲線的Tm變化確定該探針所覆蓋區域是否發生突變。采用3對引物4條探針建立雙管雙色體系體系從而實現對位于embB基因上的6個密碼子306、368、378、380、406和497的突變檢測。

1.一種結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變的檢測試劑盒，其特征在于設有盒體、擴增試劑、對照試劑和提取試劑，所述擴增試劑、對照試劑和提取試劑放置在盒體內，所述擴增試劑包括EMB?PCR?MixA、EMB?PCR?Mix?B和TB酶混合液，所述對照試劑包括EMB陽性對照和TB陰性對照，所述提取試劑為TB?DNA提取液；?所述EMB?PCR?Mix?A包括1×buffer，甘油5％，dNTP/dUTP?Mix，MgCl₂溶液3mM，0.4μM306-F，2μM306-R，0.2μM306-P，0.4μM497-F，2μM497-R，0.2μM497-P；所述1×buffer為50mM?KCl，10mM?Tris-HCl，pH=8.6；所述dNTP/dUTP?Mix為dATP、dCTP、dGTP各0.2mM，dUTP0.4mM；?所述EMB?PCR?Mix?B包括1×buffer，甘油5％，MgCl₂溶液3mM，dNTP/dUTP?Mix，0.4μM368-406-F，2μM368-406-R，0.2μM368-380-P，0.2μM406-P；所述1×buffer為50mM?KCl，10mM?Tris-HCl，pH=8.6；所述dNTP/dUTP?Mix為dATP、dCTP、dGTP各0.2mM，dUTP0.4mM；?所述EMB陽性對照為EMB野生型標準質粒；所述TB陰性對照為TB?DNA提取液、H₂O、Tris或生理鹽水；所述TB?DNA提取液的成分為乙二胺四乙酸二鈉、Tris和TritonX-100；?306-F、306-R、368-406-F、368-406R、497-F、497-R、306-P、368-380-P、406-P、497-P的具體序列為：?306-F：5′-GCGCGAATACGTCGGACAA-3′?306-R：5′-CAGCAGCGACCAGCACACTA-3′?368-406-F：5′-AGCGACGCCAGTCTGTGGAT-3′?368-406R：5′-TGGCTGTACCGCATGGACCTT-3′?497-F：5′-TTGCCGTTGGTGTCGCCGAT-3′?497-R：5′-CGGTGGGCAGGATGAGGTAGTAGT-3′?306-P：5′-FAM-TCGGCATGGCCCGAGTCGCCG-Dabcyl-3′?368-380-P：5′-TET-TTGCCGTTTGCTGGCCTCCACACCTCACGCGGCA-BHQ1-3′?406-P：5′-FAM-TGCGGCAGAGGGCATGATGCCG-BHQ1-3′?497-P：5′-TET-TGTGGGTGTTCCGCGACCAGACCCAC-BHQ1-3′。?2.一種用于非診斷和治療目的的檢驗標本的方法，其特征在于采用如權利要求1所述的一種結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變的檢測試劑盒，所述方法包括以下步驟：?1）試劑準備——配液區?①首先將所有的試劑從冰箱中取出并平衡至室溫，PCR反應液配液標準為：取n×19.6μLEMB?PCR?Mix?A和n×0.4μLTB酶混合液加入到1.5mL離心管中，振蕩混勻數秒，3000rpm離心數秒；另取n×19.6μLEMB?PCR?Mix?B和n×0.4μLTB酶混合液加入到另一1.5mL離心?管中，振蕩混勻數秒，3000rpm離心數秒，配好的PCR反應液必需貯存在-20℃并在4h內使用；?②PCR反應液的分裝，PCR反應液A/B分別以每管20μL分裝于PCR薄壁反應管；?③將配制好的PCR反應管裝入凹凸袋轉移至提取間，貯存在-20℃直至樣品提取處理完畢；?2）樣品提取及加樣——提取區?①固體培養基上生長的結核分枝桿菌，用22SWG標準接種環收集細菌1環，并懸在250μL?TB?DNA提取液中，液體培養基中生長的結核分枝桿菌取1mL，10000rpm離心15min，丟棄上清并在250μL?TB?DNA提取液中重懸細菌；?②封口膜封口,99℃加熱20min，14000rpm離心10min，轉移上清到新1.5mL離心管，上清即為PCR擴增模板；?③用微量加液器向每支PCR薄壁反應管中加入相應的提取樣品或陰/陽性對照品5μL，立即蓋嚴管蓋；?④將已加入模板的PCR薄壁反應管轉移至PCR擴增區；?3）PCR擴增——擴增區?①儀器的程序設定如下：?第一步：50℃2min，95℃10min；?第二步：95℃15s，58℃15s，74℃20s，55個循環，58℃15s處收集熒光信號；?第三步：95℃1min，35℃5min；?第四步：40～85℃，每0.5℃收集熒光信號，熒光通道選用FAM和TET；?②程序運行完畢，將PCR薄壁反應管取出放入凹凸袋，將封口封嚴，按污染源處理；?（3）試劑盒的參考值?陽性對照，即野生型在各體系及各通道中的T_m值范圍如下：反應體系A中FAM通道野生型對照峰的Tm值為66.5℃±1℃；TET通道野生型對照峰的Tm值為61.5℃±1℃；反應體系B中FAM通道野生型對照峰的Tm值為64.5℃±1℃；TET通道野生型對照峰的Tm值為67.5℃±1℃；?其中各T_m值是在特定Bio-Rad?CFX96儀器上所得的常見值，作為參考，當使用其它儀器時，T_m值可能略有變動，以當次試驗陽性對照所得的T_m值為準；?T_m值以儀器自動判讀所得為準，當儀器給出一個以上T_m值時，請參考陽性對照和陰性對照的峰型選擇有效T_m值；當出現儀器無法自動給出T_m值的情況時，通過調整基線或直接人工判讀的方法獲得T_m值。?