發明人首次選用TMEM176A基因作為目標基因，通過MSP技術證明在食管癌、結腸癌細胞中啟動子區呈高甲基化狀態，具有首創性。本發明提供用于檢測細胞TMEM176A基因啟動子區甲基化狀態的引物及試劑盒，引物為一對甲基化引物或為一對甲基化引物和一對非甲基化引物。利用本發明所述引物及試劑盒檢測食管癌的特異性好，其中在食管癌中為61.2％，結直腸癌53.13％；靈敏度高，達到0.5％，即1000個細胞中有5個癌細胞就能夠被檢測出。應用本發明試劑盒來檢測TMEM176A基因啟動子區高甲基化狀態可作為消化系腫瘤診斷、療效觀察、預后判斷、微小殘留病檢測等的有力手段，而且，操作簡便、穩定性好，具有深遠的臨床意義和推廣性。

1.一種用于檢測細胞TMEM176A基因啟動子區甲基化狀態的引物對，其為甲基化引物，
其上游引物核苷酸序列如Primer-MF所述，即：5'GAAGAAAGACGTTTTGTGGATAGGAC 3'，下游引
物核苷酸序列如Primer-MR所述，即：5'CTAATATCCGCTCTACTCGACCGCG 3'。
2.一種用于檢測細胞TMEM176A基因啟動子區甲基化狀態的引物對，包括甲基化引物對
和非甲基化引物對，所述甲基化引物對如權利要求1所述用于檢測細胞TMEM176A基因啟動
子區甲基化狀態的引物對，所述非甲基化引物對的上游引物核苷酸序列如Primer-UF所述，
即：5'GGAAGAAAGATGTTTTGTGGATAGGAT 3'，下游引物核苷酸序列如Primer-UR所述，即：5'
CAACTAATATCCACTCTACTCAACCACA 3'。
3.一種檢測細胞TMEM176A基因啟動子區甲基化狀態的試劑盒，其特征在于：包含權利
要求1或2所述的引物對。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：還包含甲基化陽性對照PCR模板，該模板
為硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區100％甲基化的食管癌、結直腸癌細胞DNA。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：還包含非甲基化陽性對照PCR模板，該模
板為硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區100％非甲基化的正常食管、結直腸細胞DNA。
6.根據權利要求3至5任一項所述的試劑盒，其特征在于：還包含MS-PCR反應所需的下
列成分：10×MSP buffer緩沖液，20mMdNTP，hotstar taq酶，去離子水。
7.一種用于檢測細胞TMEM176A基因啟動子區甲基化狀態的MS-PCR反應體系，以總體積
25ul計，其包括：
(1)模板：2ul；
(2)濃度為50pmol/ul的權利要求1所述的用于檢測細胞TMEM176A基因啟動子區甲基化
狀態的甲基化引物對和權利要求2中所述的用于檢測細胞TMEM176A基因啟動子區甲基化狀
態的引物對中的非甲基化引物對，其中，上游引物與下游引物各為0.5ul；
(3)10×MSP buffer緩沖液：2.5ul；
(4)20mMdNTP：1.25ul；
(5)hot start taq酶：0.5ul；
(6)去離子水：17.75ul；
其中，所述模板為硫化修飾后的待測細胞DNA，或硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區
為100％甲基化的食管癌、結直腸癌細胞DNA，或硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區為
100％非甲基化的正常食管、結直腸細胞DNA。