1.反應混合物,其包含:
(a)核酸分子;
(b)等位基因特異性引物,其中等位基因特異性引物的等位基因特異性
核苷酸部分與靶序列的第一等位變體互補,并且其中等位基因特異性引物
包含至少一個核酸修飾;
(c)與包含第二等位變體的靶序列區域互補的等位基因特異性阻斷探
針,其中等位基因特異性阻斷探針包含不可延伸性3'-己二醇阻斷部分和至
少一個核酸修飾;
(d)檢測探針;和
(e)與靶序列的區域互補的基因座特異性引物,其中與基因座特異性引
物互補的靶序列的區域是第一等位變體的3’并在相反鏈上。
2.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性引物中的至少一個
核酸修飾之一位于等位基因特異性核苷酸部分處。
3.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性引物中的至少一個
核酸修飾之一位于等位基因特異性引物的5'末端和/或3'末端處。
4.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性引物包含兩個或多
個不相鄰核酸修飾。
5.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性引物中的核酸修飾
選自鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、拉鏈核酸(ZNA)、三
唑核酸(TzNA)和它們的組合。
6.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性阻斷探針中的至少
一個核酸修飾之一位于等位基因特異性核苷酸部分處。
7.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性阻斷探針中的至少
一個核酸修飾之一位于等位基因特異性阻斷探針中的內部位置處。
8.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性阻斷探針包含兩個
或多個不相鄰核酸修飾。
9.權利要求1的反應混合物,其中等位基因特異性阻斷探針中的核酸
修飾選自鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、拉鏈核酸(ZNA)、
三唑核酸(TzNA)和它們的組合。
10.權利要求1的反應混合物,其中檢測探針包含
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探針。
11.權利要求1的反應混合物,其中核酸分子從選自血液、血清、血漿、
細針抽吸物、腫瘤組織和其組合的樣品獲得。
12.權利要求1至11中任一項所述的反應混合物,其中第一等位變體
是突變等位基因并且第二等位變體是野生型等位基因。
13.權利要求1至12中任一項所述的反應混合物的用途,用于制備檢
測或定量疑似至少具有靶序列的第二等位變體的核酸樣品中靶序列的第
一等位變體的試劑盒。
14.組合物,其包含:
(a)等位基因特異性引物,其中等位基因特異性引物的等位基因特異性
核苷酸部分與靶序列的第一等位變體互補,并且其中等位基因特異性引物
包含至少一個核酸修飾;和
(b)與包含第二等位變體的靶序列區域互補的等位基因特異性阻斷探
針,其中等位基因特異性阻斷探針包含不可延伸性3'-己二醇阻斷部分和至
少一個核酸修飾。
15.權利要求14的組合物,其還包含:(c)檢測探針;和/或(d)與靶序
列的區域互補的基因座特異性引物,其中與基因座特異性引物互補的靶序
列的區域是第一等位變體的3’并在相反鏈上。
16.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性引物中的至少一個核
酸修飾之一位于等位基因特異性核苷酸部分處。
17.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性引物中的至少一個核
酸修飾之一位于等位基因特異性引物的5'末端和/或3'末端處。
18.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性引物包含兩個或多個
不相鄰核酸修飾。
19.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性引物中的核酸修飾選
自鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、拉鏈核酸(ZNA)、三唑
核酸(TzNA)和它們的組合。
20.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性阻斷探針中的至少一
個核酸修飾之一位于等位基因特異性核苷酸部分處。
21.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性阻斷探針中的至少一
個核酸修飾之一位于等位基因特異性阻斷探針中的內部位置處。
22.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性阻斷探針包含兩個或
多個不相鄰核酸修飾。
23.權利要求14的組合物,其中等位基因特異性阻斷探針中的核酸修
飾選自鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、拉鏈核酸(ZNA)、
三唑核酸(TzNA)和它們的組合。
24.權利要求14至23中任一項所述的組合物,其中第一等位變體是突
變等位基因并且第二等位變體是野生型等位基因。
25.權利要求14至24中任一項所述的組合物的用途,用于制備檢測或
定量疑似至少具有靶序列的第二等位變體的核酸樣品中靶序列的第一等
位變體的試劑盒。
26.試劑盒,其包含兩個或更多個含有獨立分布在兩個或更多個容器之
一中的以下組分的容器:
(a)等位基因特異性引物,其中等位基因特異性引物的等位基因特異性
核苷酸部分與靶序列的第一等位變體互補,并且其中等位基因特異性引物
包含至少一個核酸修飾;和
(b)與包含第二等位變體的靶序列區域互補的等位基因特異性阻斷探
針,其中等位基因特異性阻斷探針包含不可延伸性3'-己二醇阻斷部分和至
少一個核酸修飾。
27.權利要求26所述的試劑盒,其還包含:(c)檢測探針;和/或(d)與
靶序列的區域互補的基因座特異性引物,其中與基因座特異性引物互補的
靶序列的區域是第一等位變體的3’并在相反鏈上。
28.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性引物中的至少一
個核酸修飾之一位于等位基因特異性核苷酸部分處。
29.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性引物中的至少一
個核酸修飾之一位于等位基因特異性引物的5'末端和/或3'末端處。
30.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性引物包含兩個或
多個不相鄰核酸修飾。
31.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性引物中的核酸修
飾選自鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、拉鏈核酸(ZNA)、
三唑核酸(TzNA)和它們的組合。
32.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性阻斷探針中的至
少一個核酸修飾之一位于等位基因特異性核苷酸部分處。
33.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性阻斷探針中的至
少一個核酸修飾之一位于等位基因特異性阻斷探針中的內部位置處。
34.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性阻斷探針包含兩
個或多個不相鄰核酸修飾。
35.權利要求26所述的試劑盒,其中等位基因特異性阻斷探針中的核
酸修飾選自鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、拉鏈核酸
(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它們的組合。
36.權利要求26所述的試劑盒,其中第一等位變體是突變等位基因并
且第二等位變體是野生型等位基因。
37.權利要求26至36中任一項所述的試劑盒,其還包括用于檢測或定
量疑似具有靶序列的第二等位變體的核酸樣品中靶序列的第一等位變體
的等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷探針的使用說明書。