1.一種褐潮藻種檢測方法，其特征在于包括以下步驟：
1)設計并合成特異性引物AanF、AanR和探針Aan probe；
所述引物AanF序列為SEQ ID NO.1所示的序列：AAAGCTCGTAGTTGGATTCCTGG；
所述引物AanR序列為SEQ ID NO.2所示的序列：GTGTTCAACGCAGGCTTACG；
所述探針Aan probe序列為SEQ ID NO.3所示的序列：CTTGCGATGGTCTATCCT；
2)構建重組質粒標準品，包括以下步驟：
a)選擇標準品藻株Aureococcus anophagefferens CCMP1784，培養，獲得標準品藻株
培養液；
b)收集步驟a)中標準品藻株培養液，測藻細胞數后過濾，收集藻細胞；
c)將步驟b)收集的藻細胞提取DNA，并利用引物SSU-F和SSU-R進行PCR擴增后測序驗
證，當測序結果與預期序列一致后，即得到藻細胞標準品DNA提取液；其中所述引物SSU-F的
序列為SEQ ID NO.4所示的序列：ACCTGGTTGATCCTGCCAGT；所述引物SSU-R的序列為SEQ ID
NO.5所示的序列：TCACCTACGGAAACCTTGT；
d)以步驟c)得到的藻細胞標準品DNA提取液為模板、利用引物AanF和引物AanR進行PCR
擴增，純化，得到純化后的PCR產物；利用純化后的PCR產物構建重組質粒，得到重組質粒標
準品；
3)構建標準曲線：構建重組質粒標準品的Ct-質粒拷貝數標準曲線，構建藻細胞標準品
DNA提取液的Ct-藻細胞數標準曲線，通過上述兩個標準曲線獲得重組質粒標準品的質粒拷
貝數-藻細胞數標準曲線；
4)引物AanF、引物AanR、探針Aan probe特異性驗證；
5)檢測樣品和結果分析：提取待測樣品中的DNA，以待測樣品DNA提取液為模板，利用引
物AanF、引物AanR和探針Aan Probe進行熒光定量PCR擴增，得到Ct值，根據步驟3)所述的
Ct-質粒拷貝數標準曲線、Ct-藻細胞數標準曲線、質粒拷貝數-藻細胞數標準曲線來計算藻
細胞數，將藻細胞數除以待測樣品的體積，得到藻細胞密度。
2.根據權利要求1所述的褐潮藻種檢測方法，其特征在于在步驟3)中，所述構建標準曲
線的方法包括以下步驟：
a)將步驟2)得到的重組質粒標準品，稀釋成不同濃度，分別以不同濃度的重組質粒標
準品為模板，利用引物AanF、引物AanR、探針Aan probe進行熒光定量PCR擴增，得到第一Ct
值；以質粒拷貝數的對數值與所述第一Ct值進行線性回歸分析，獲得Ct-質粒拷貝數標準曲
線；
b)將步驟2)得到的藻細胞標準品DNA提取液稀釋成不同濃度，作為模板，利用引物
AanF、引物AanR、探針Aan probe進行熒光定量PCR擴增，得到第二Ct值；將藻細胞數的對數
值與所述第二Ct值進行線性回歸分析，獲得Ct-藻細胞數標準曲線；
c)根據步驟a)中獲得的Ct-質粒拷貝數標準曲線和步驟b)中獲得的Ct-藻細胞數標準
曲線，最后得到質粒拷貝數-藻細胞數標準曲線。
3.根據權利要求1所述的褐潮藻種檢測方法，其特征在于，在步驟4)中所述引物和探針
特異性驗證的方法為：分別提取中肋骨條藻、三角褐指藻、海洋小球藻和海洋原甲藻中的
DNA，分別以雙蒸水、中肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小球藻DNA提取液
和海洋原甲藻DNA提取液為陰性對照，以引物AanF、引物AanR和探針Aan Probe進行熒光定
量PCR擴增，當檢測不到擴增曲線時，說明所用引物和探針不能用于這些樣品的檢測。
4.根據權利要求1所述的褐潮藻種檢測方法，其特征在于，在步驟5)中，所述檢測樣品
和結果分析方法，包括以下步驟：
a)提取待測樣品DNA：采集表層水樣，記錄待測樣品的體積，過濾，收集藻細胞；提取收
集的藻細胞的DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，分裝，保存，作為待測樣品DNA提取液；
b)以步驟a)得到的待測樣品DNA提取液為模板，以引物AanF、引物AanR和探針Aan
Probe進行熒光定量PCR擴增，得到Ct值，根據步驟3)得到的Ct-質粒拷貝數標準曲線、Ct-藻
細胞數標準曲線、質粒拷貝數-藻細胞數標準曲線，計算待測樣品中的藻細胞數，除以待測
樣品的體積，得到藻細胞密度。
5.一種利用權利要求1所述的褐潮藻種檢測方法制備的褐潮藻種檢測試劑盒，其特征
在于，包括：重組質粒標準品、藻細胞標準品DNA提取液、引物AanF、引物AanR、引物SSU-F、引
物SSU-R、探針Aan probe、陰性對照，和熒光定量PCR擴增試劑。
6.根據權利要求5所述的褐潮藻種檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR擴增試
劑包括：2×PROBE FAST qPCR Master Mix Universal、ROX校正染料，和PCR級無菌水。
7.根據權利要求5所述褐潮藻種檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為雙蒸水、中
肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小球藻DNA提取液，和海洋原甲藻DNA提取
液。
8.一種利用權利要求5-7任一項所述的褐潮藻種檢測試劑盒在褐潮藻種定性和/或定
量檢測中的應用。
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