從腐爛的海藻分離到的嗜鹽海洋革蘭氏陰性細菌能夠水解κ-角叉菜聚糖。為了以成本合算的方式最大化κ-角叉菜聚糖酶的生產，通過統計學優化方法確定了具有最少組分和它們的最適濃度的新培養基。因此開發出了新的培養基組合物，用于通過新的耐鹽海洋細菌假單胞菌提高κ-角叉菜聚糖酶的生產。

1.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在30℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.003g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.01g.100ml^-1酵母提取物、
0.3g.100ml^-1氯化鈉、0.04g.100ml^-1K₂HPO₄和0.003g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH6.3；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用50％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在10mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
2.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在30℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.03g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.01g.100ml^-1酵母提取物、
0.3g.100ml^-1氯化鈉、0.004g.100ml^-1K₂HPO₄和0.03g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH8.4；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用40％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在15mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
3.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在35℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.03g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.1g.100ml^-1酵母提取物、
0.3g.100ml^-1氯化鈉、0.004g.100ml^-1K₂HPO₄和0.003g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH5.1；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用55％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在20mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
4.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在40℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.03g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.1g.100ml^-1酵母提取物、
3.0g.100ml^-1氯化鈉、0.004g.100ml^-1K₂HPO₄和0.003g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH8.0；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用70％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在25mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
5.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在25℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.003g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.1g.100ml^-1酵母提取物、
3.0g.100ml^-1氯化鈉、0.04g.100ml^-1K₂HPO₄和0.003g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH8.4；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用30％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在15mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
6.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在25℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.03g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.01g.100ml^-1酵母提取物、
3.0g.100ml^-1氯化鈉、0.04g.100ml^-1K₂HPO₄和0.03g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH7.1；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用40％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在15mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
7.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在40℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.03g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.1g.100ml^-1酵母提取物、
0.3g.100ml^-1氯化鈉、0.04g.100ml^-1K₂HPO₄和0.03g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH9.0；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用75％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在30mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
8.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在30℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.003g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.1g.100ml^-1酵母提取物、
3.0g.100ml^-1氯化鈉、0.004g.100ml^-1K₂HPO₄和0.03g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH7.1；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用65％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在25mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
9.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在30℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.03g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.01g.100ml^-1酵母提取物、
3.0g.100ml^-1氯化鈉、0.04g.100ml^-1K₂HPO₄和0.003g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH6.3；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用55％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在15mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
10.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步
驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在35℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.003g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.1g.100ml^-1酵母提取物、
0.3g.100ml^-1氯化鈉、0.04g.100ml^-1K₂HPO₄和0.03g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH5.1；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用35％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在25mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
11.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步
驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在40℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.003g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.01g.100ml^-1酵母提取物、
3.0g.100ml^-1氯化鈉、0.004g.100ml^-1K₂HPO₄和0.03g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH4.5；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用70％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在30mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
12.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步
驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在35℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.003g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.01g.100ml^-1酵母提取物、
0.3g.100ml^-1氯化鈉、0.004g.100ml^-1K₂HPO₄和0.003g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH5.1；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用40％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在15mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。
13.用于制備κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步
驟：
(i)將登記號為MTCC?5261的耐鹽海洋細菌假單胞菌
(Pseudomonas?sp.)在35℃培養于液體培養基中28小時以獲得培養物，
所述培養基含有0.3g.100ml^-1角叉菜聚糖、0.04g.100ml^-1酵母提取物、
3.0g.100ml^-1氯化鈉、0.03g.100ml^-1K₂HPO₄和0.01g.100ml^-1KH₂PO₄，
pH5.6；
(ii)將從步驟(i)獲得的培養物在8000rpm離心15分鐘，獲得作為
上清液的無細胞提取液；
(iii)從步驟(ii)獲得的上清液中純化粗酶，是通過用60％硫酸銨在
4℃的溫度下處理上清液，將混合物老化24小時的一段時間，然后在
4℃下以8000rpm離心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；
(iv)將從步驟(iii)獲得的沉淀懸浮在20mM?Tris-HCl緩沖溶液中；
和
(v)將在步驟(iv)中獲得的懸浮液透析以除去附著的硫酸銨，然后
通過凝膠過濾得到所需的純化κ-角叉菜聚糖酶。