1.青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是包括如下步驟:
(1)細胞內蛋白的提取:
在LB培養基中接種青霉菌,培養,從接種1h或2h起至170h或180h,選8~12個時間點,每個時
間點收集1~3份細胞,每份細胞分別用冰浴的0.5~5mM苯甲基磺酰化氟-超純水溶液洗滌3~5次;
-10~4℃收集洗滌后的細胞,在液氮中研磨成細胞粉末;取0.1~1g所述細胞粉末懸浮于裂解緩沖液
中,再加入10~15μl?DNaseⅠ和RNaseA的水溶液,冰浴放置15~30min,加入10~15μl濃度為0.8~
1.2mM苯甲基磺酰化氟-異丙醇溶液,超聲10~15秒/次,共3~5次,以10,000~100,000×g的轉速離
心10~60min后,收集上清液,在-15~-30℃的條件下與1~10倍于上清液體積的冰浴的丙酮混合,
放置2~10h;再以10,000~100,000×g的轉速離心10~60min,將沉淀物凍干,得到細胞內蛋白組,
測定蛋白含量;
所述裂解緩沖液的配制為:5~8mol尿素、1~3mol硫脲、10~50mg?3-((3-膽汁氨丙
基)二甲基胺)-1-丙磺酸、20~50mmol?Tris堿,加水定容至1L;
所述DNaseⅠ和RNaseA的水溶液的配制為:8~15mg?DNaseI,2~4mg?RNaseA、30~
60mmol?MgCl2、0.1~1mol?Tris-HCl,調pH為7.0,加水定容至1L;
(2)細胞外蛋白的提取:
在LB培養基中接種青霉菌,培養,在生長周期的OD540值分別在1~10之間取3-5份1L
的發酵液,在1~10℃,10,000~100,000×g離心10~60min,上清液通過0.1~1μm孔徑過
濾,濾液加入冰浴的三氯乙酸至三氯乙酸終濃度為10~20mg/100ml,進行沉淀,用體積濃
度為80%-90%的丙酮水溶液洗滌沉淀4-5次,得到細胞外蛋白組,測定蛋白含量。
2.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述時間點為10個,
每個時間點收集2~3份細胞。
3.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述苯甲基磺酰化氟-
超純水溶液的濃度為1~2mM。
4.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(1)或步驟
(2)中轉速為20,000×g,離心時間為40min。
5.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述DNaseⅠ和RNaseA
的水溶液的配制中所述DNaseⅠ為10~12mg。
6.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述DNaseⅠ和RNaseA
的水溶液的配制中所述RNaseA為2.5~3mg。
7.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述苯甲基磺酰化氟-
異丙醇溶液的濃度為1mM。
8.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(1)中上清
液與冰浴的丙酮混合時的溫度條件為-20℃。
9.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(2)中發酵
液的份數為4份。
10.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(2)中所述
孔徑為0.45μm。
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