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青霉菌細胞內外蛋白質組的提取

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-19
  • 技術成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201210066837.7 
  • 技術(專利)名稱 青霉菌細胞內外蛋白質組的提取 
  • 項目單位 天津大學
  • 發明人 元英進,程景勝,喬斌,丁明珠,盧華,陳堯 
  • 行業類別 醫藥制造-原料藥
  • 技術成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 許宛瑩
  • 發布時間 2021-12-19  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,包括如下步驟:(1)細胞內蛋白的提取:在LB培養基中接種青霉菌,培養,選8~12個時間點,收集細胞,每份細胞在液氮中研磨成細胞粉末;懸浮于裂解緩沖液中,加入DNase I和RNaseA的水溶液,加入苯甲基磺酰化氟-異丙醇溶液,超聲,離心收集上清液,與丙酮混合,放置;離心,將沉淀物凍干,得到細胞內蛋白組,測定蛋白含量;(2)細胞外蛋白的提取:利用本發明的方法可以方便有效的提取蛋白,為鑒定不同工業發酵條件下蛋白變化奠定了基礎。
    展開
  • 02

    說明書

    1.青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是包括如下步驟:
    (1)細胞內蛋白的提取:
    在LB培養基中接種青霉菌,培養,從接種1h或2h起至170h或180h,選8~12個時間點,每個時
    間點收集1~3份細胞,每份細胞分別用冰浴的0.5~5mM苯甲基磺酰化氟-超純水溶液洗滌3~5次;
    -10~4℃收集洗滌后的細胞,在液氮中研磨成細胞粉末;取0.1~1g所述細胞粉末懸浮于裂解緩沖液
    中,再加入10~15μl?DNaseⅠ和RNaseA的水溶液,冰浴放置15~30min,加入10~15μl濃度為0.8~
    1.2mM苯甲基磺酰化氟-異丙醇溶液,超聲10~15秒/次,共3~5次,以10,000~100,000×g的轉速離
    心10~60min后,收集上清液,在-15~-30℃的條件下與1~10倍于上清液體積的冰浴的丙酮混合,
    放置2~10h;再以10,000~100,000×g的轉速離心10~60min,將沉淀物凍干,得到細胞內蛋白組,
    測定蛋白含量;
    所述裂解緩沖液的配制為:5~8mol尿素、1~3mol硫脲、10~50mg?3-((3-膽汁氨丙
    基)二甲基胺)-1-丙磺酸、20~50mmol?Tris堿,加水定容至1L;
    所述DNaseⅠ和RNaseA的水溶液的配制為:8~15mg?DNaseI,2~4mg?RNaseA、30~
    60mmol?MgCl2、0.1~1mol?Tris-HCl,調pH為7.0,加水定容至1L;
    (2)細胞外蛋白的提取:
    在LB培養基中接種青霉菌,培養,在生長周期的OD540值分別在1~10之間取3-5份1L
    的發酵液,在1~10℃,10,000~100,000×g離心10~60min,上清液通過0.1~1μm孔徑過
    濾,濾液加入冰浴的三氯乙酸至三氯乙酸終濃度為10~20mg/100ml,進行沉淀,用體積濃
    度為80%-90%的丙酮水溶液洗滌沉淀4-5次,得到細胞外蛋白組,測定蛋白含量。
    2.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述時間點為10個,
    每個時間點收集2~3份細胞。
    3.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述苯甲基磺酰化氟-
    超純水溶液的濃度為1~2mM。
    4.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(1)或步驟
    (2)中轉速為20,000×g,離心時間為40min。
    5.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述DNaseⅠ和RNaseA
    的水溶液的配制中所述DNaseⅠ為10~12mg。
    6.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述DNaseⅠ和RNaseA
    的水溶液的配制中所述RNaseA為2.5~3mg。
    7.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述苯甲基磺酰化氟-
    異丙醇溶液的濃度為1mM。
    8.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(1)中上清
    液與冰浴的丙酮混合時的溫度條件為-20℃。
    9.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(2)中發酵
    液的份數為4份。
    10.根據權利要求1所述的青霉菌細胞內外蛋白質組的提取,其特征是所述步驟(2)中所述
    孔徑為0.45μm。
    展開

專利技術附圖

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