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植原體探針、基因芯片以及檢測植原體的方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-27
  • 技術成熟度:詳情咨詢
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN200910188508.8 
  • 技術(專利)名稱 植原體探針、基因芯片以及檢測植原體的方法 
  • 項目單位 深圳職業技術學院
  • 發明人 張麗君,羅煥亮,吳曉明 
  • 行業類別 智慧健康-其他
  • 技術成熟度 詳情咨詢
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 陳樂培
  • 發布時間 2021-12-27  
  • 01

    項目簡介

    本發明涉及植原體探針,包含該探針的基因芯片以及利用該基因芯片檢測植原體的方法。該植原體探針為針對11種植原體的特異性探針,點樣制成基因芯片,檢測植原體包括以下步驟:植物DNA樣品提取;利用通用引物對樣品特異性片段擴增并對產物進行標記;雜交:將待測標記的樣品加入雜交緩沖液中,混勻成雜交混合液,將混合液滴加入基因芯片的雜交區域,放入雜交盒雜交;取出雜交后的芯片并干燥后,進行掃描及數據分析,判斷樣品中有無植原體的存在。利用本發明的探針制成的基因芯片可快速、高效、高通量檢測11種植原體。
    展開
  • 02

    說明書

    1.探針,針對選自序列表中SEQ?ID?NO.?1植原體的16sDNA核苷酸序列,所述的探針序列選自表1中對應植原體AY685056的一條特異性探針序列AY685056-10。2.如權利要求1所述的探針,其特征在于:進一步包括選自表1中對應植原體AY685056的特異性探針序列AY685056-1、AY685056-11、AY685056-2、AY685056-4、AY685056-5、AY685056-6、AY685056-8、AY685056-9中的一條或幾條的組合。3.基因芯片,包含如權利要求1-2中任一項所述的探針。4.如權利要求3所述的基因芯片,其特征在于:所述芯片還包含陰性對照和陽性對照,陰性對照探針選取一段人類基因的保守序列選自序列表中SEQ?ID?NO.?17-20,與植原體序列沒有同源性,陰性對照探針選自表1中H28302128、H34916057、H4504152、H47060296對應的序列;陽性對照探針分別來自于5個小鼠管家基因序列選自序列表中SEQ?ID?NO.?12-16,所述陽性對照探針選自表1中M3116F01、M3116F10、M3116E05、M3116D01、M3157F03對應的序列。5.如權利要求3所述的基因芯片,其特征在于:所述芯片包括上下兩個重復的點樣區,每個獨立的點樣區包括四個小的矩陣,每個矩陣包括8行19列共152個探針點,其中每一列為同一個探針的重復。6.如權利要求5所述的基因芯片,其特征在于:所述芯片基質選自玻片、硅片、金屬片或膜中的一種。7.一種利用如權利要求3-6中任一項所述的基因芯片檢測廣州桑樹植原體的方法,包括以下步驟:(1)植物DNA樣品提取;(2)利用通用引物對樣品特異性片段擴增并對產物進行標記,所述通用引物選自表2的6對通用擴增引物為:Sense1、Antisense1、Sense2、Antisense2、Sense3、Antisense3、Sense4、Antisense4、Sense5、Antisense5、Sense6、Antisense6;陽性對照為選自表2的外參照通用引物1和2;(3)雜交:將待測標記的樣品加入雜交緩沖液中,混勻成雜交混合液,將混合液滴加入基因芯片的雜交區域,放入雜交盒雜交;(4)取出雜交后的芯片并干燥后,進行掃描及數據分析,判斷樣品中有無廣州桑樹植原體的存在。8.如權利要求7所述的檢測植原體的方法,其特征在于:所述第(2)步擴增及標記包括以下工藝步驟:1)PCR擴增:其中特異性擴增反應體系:DNA樣品???????????????????????0.1μg擴增引物對??????????????????????1μL10×PCR?Buffer???????????????????2μL2.5mM?d(AGT)TP?mix??????????????2μL0.25mM?dCTP?????????????????????2μL25μM?Cy3-dCTP??????????????????2μLrTaqase?????????????????????????0.3μL加滅菌水至終體積????????????????20μL特異性擴增反應條件:95℃×5分鐘;95℃×15秒,55℃×15秒,72℃×15秒共40個循環;72℃延伸5分鐘,4℃冷卻;2)采用QIAquick?PCR?Purification?Kit純化擴增標記產物,步驟如下:a)加入5倍體積的Buffer?PB,混勻后,轉移到mini?spin?純化柱中;b)離心13000rpm×1分鐘,棄收集套管中的液體;c)加入500μL緩沖液PE,離心13000?rpm×1?min,棄收集套管中的液體;d)重復操作c)一次;e)不加試劑,離心13000?rpm×1?min,棄去收集套管,換成1.5ml的離心管;f)加入Buffer?EB?40μL,離心13000?rpm×1?min;g)再加入Buffer?EB?20μL,離心13000?rpm×1?min,合并純化產物。9.如權利要求7所述的檢測植原體的方法,其特征在于:所述第(3)步驟雜交工藝進一步包括以下步驟:1)預雜交或預處理:將芯片放入盛有預雜交緩沖液的染色缸中進行預處理20-30分鐘,之后取出芯片并吹干表面;2)雜交:將標記好的樣品抽干后重溶于3μL滅菌水,95℃水浴變性5分鐘,冰上冷卻5分鐘,加入32μL雜交緩沖液,混勻成雜交混合液,將混合液滴加入基因芯片的雜交區域,蓋上蓋玻片,將芯片放入雜交盒進行雜交處理;3)洗片:雜交結束后取出芯片,放入盛有去離子水的染色缸中洗片,再放入盛有洗脫液的染色缸中洗片,之后取出芯片并吹干表面。
    展開

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