本發明屬于DNA生物合成領域，具體涉及一種合成短單鏈脫氧核糖核苷酸探針方法及其應用，可用于檢測小的非編碼核糖核酸，如微核糖核酸,包括如下步驟：（1）制備重組有模板DNA的質粒；（2）切割并連接模板DNA，從重組質粒上酶切獲得模板DNA，使模板DNA首尾連接成環；（3）切單鏈，滾環復制，用切口酶切斷模板DNA的一條鏈，加入聚合酶以環狀帶切口的DNA為模板進行滾環復制，擴增出含頸環-探針結構的DNA單鏈；（4）目的短單鏈DNA的制備，對步驟（3）的產物采用Ⅱ型內切酶切割形成目的單鏈DNA探針和副產物DNA，通過PAGE分離純化得到無突變的單鏈DNA探針。本發明在小非編碼RNA檢測領域和小非編碼RNA相關疾病的診斷和治療領域具有廣泛用途。

1.一種合成短單鏈脫氧核糖核苷酸探針的方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)制備重組有模板DNA的質粒
設計模板DNA序列：模板DNA為雙鏈，兩端含有相同的酶切位點；模板DNA設有至少一個頸環-探針
結構，所述頸環為含內切酶位點的可成環結構，所述探針為與任一微RNA完全互補的單鏈DNA探針；
模板DNA還帶有切口酶位點；
合成所述的模板DNA并連接至質粒中，經測序驗證無突變并擴增；
(2)酶切并連接模板DNA
從重組質粒上酶切獲得模板DNA，使模板DNA首尾連接成環；
(3)切單鏈，滾環復制
用切口酶切斷模板DNA的一條鏈，加入phi29DNA聚合酶以環狀帶切口的DNA為模板進行滾環復制，
擴增出含頸環-探針結構的DNA單鏈；
(4)目的短單鏈DNA的制備
對步驟(3)的自發形成頸環二級結構的DNA單鏈產物采用內切酶切割，在頸環和DNA探針序列之間切
斷，形成與微RNA完全互補的目的單鏈DNA探針和副產物DNA，通過PAGE分離純化得到含單一序
列的無突變的單鏈DNA探針。
2.根據權利要求1所述的一種合成短單鏈脫氧核糖核苷酸探針的方法，其特征在于：所述的內切酶為
BtsCI或BspPI，所述的內切酶位點為BtsCI位點或BspPI位點，內切酶與內切酶位點相對應。
3.根據權利要求1所述的一種合成短單鏈脫氧核糖核苷酸探針的方法，其特征在于：所述的切口酶位點
為Nt.BstNBI位點，所述的切口酶為Nt.BstNBI。
4.根據權利要求1所述的一種合成短單鏈脫氧核糖核苷酸探針的方法，其特征在于：采用末端轉移酶在
純化后的單鏈DNA探針端部加上標記物；或者在聚合酶擴增時加入帶標記物的擴增底物。
5.根據權利要求4所述的一種合成短單鏈脫氧核糖核苷酸探針的方法，其特征在于：所述的標記物包括
地高辛、熒光素、生物素或同位素。
6.根據權利要求1所述的一種合成短單鏈脫氧核糖核苷酸探針的方法，其特征在于：所述的目的單鏈
DNA探針大小為10-30bp。