本發(fā)明公開了一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，包括：PCR體系中引入了與核酸模板互補(bǔ)的探針和特異性引物，設(shè)定PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)采集；擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，擴(kuò)增程序直接進(jìn)入熔解曲線分析程序，并收集熔解曲線過(guò)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度；本發(fā)明是基于酶水解探針產(chǎn)生熒光信號(hào)及特異性引物擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)的兩種技術(shù)原理，針對(duì)單色熒光通道中一個(gè)靶點(diǎn)的檢測(cè)采用探針，另一個(gè)靶點(diǎn)的檢測(cè)采用熔解曲線的方式，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在單色的熒光通道中同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)核酸靶點(diǎn)的檢測(cè)和分析。

1.一種用于單通道雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括：
PCR體系中引入了與核酸模板互補(bǔ)的探針和特異性引物，設(shè)定PCR擴(kuò)增程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)
增循環(huán)，所述PCR擴(kuò)增循環(huán)的過(guò)程中，每個(gè)循環(huán)均在延伸步驟中進(jìn)行實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度采
集，并通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析；所述探針的5’端標(biāo)
記熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針的3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)；所述特異性引物標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)和引
物熒光報(bào)告基團(tuán)；所述特異性引物擴(kuò)增后，產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)；
所述PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，通過(guò)采集的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)
靶序列二進(jìn)行定性分析；
所述通過(guò)采集的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列二進(jìn)行定性分
析的步驟包括：
采集所述特異性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化繪制熔解曲線對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶
序列二進(jìn)行定性分析；
所述目標(biāo)靶序列一為甲型流感InfA；
所述目標(biāo)靶序列二為甲型流感InfB；
所述特異性引物的5’端修飾標(biāo)記引物猝滅基團(tuán)，所述特異性引物中間位置標(biāo)記引物熒
光報(bào)告基團(tuán)；
所述引物猝滅基團(tuán)與所述引物熒光報(bào)告基團(tuán)之間的間距為15-25nt。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化
對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析的步驟包括：
通過(guò)酶水解所述探針產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)靶序列一進(jìn)行定性分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述探針的Tm值高于所述特異性引物
的Tm值5℃-10℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增程序包括；
預(yù)變性和酶激活溫度為95℃，時(shí)間為1min；
逆轉(zhuǎn)錄溫度為60℃，時(shí)間為30min；
cDNA預(yù)變性溫度為95℃，時(shí)間為1min；
變性溫度為95℃，時(shí)間為15s；
退火溫度為60℃，時(shí)間為30s；
延伸及熒光采集的溫度為72℃，時(shí)間為30s；
熔解曲線分析的溫度為55℃-95℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述目標(biāo)靶序列二特異性引物的核酸
序列為：SEQ ID NO:4[BHQ1]-TTCAAATATCAGACAAAAACAAAACCAA[T(FAM)]CC和SEQ ID NO:
5TGTCTATTTTGTTGCTTTAATAATCGAG。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述探針的核酸序列為：SEQ ID NO:
3CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC。