本發明的實施方案公開了設計標記的核酸探針和引物的新方法，其通過用多個光譜相同的或相似的染料和任選用一種或者多種淬滅染料標記寡核苷酸。當標記的染料彼此分開時，根據本發明一些實施方案標記的寡核苷酸顯示出信號例如熒光信號的可檢測的增加。分離染料的方法包括切割標記的寡核苷酸，包括使用具有5′-核酸外切酶活性的酶。在一個實施方案中，本發明的核酸引物可以在雜交到靶序列和摻入到擴增產物后發熒光。本發明的核酸探針和引物具有廣泛的應用，從靶核酸序列的一般檢測到臨床診斷。包含本發明許多實施方案的核酸探針和引物的寡核苷酸的主要優點是其合成的簡便性，光譜通用性和優異的熒光信號。

1.一種標記的寡核苷酸，包括：
與靶多核苷酸序列雜交的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在其
3′末端被封閉以阻止延伸入產物中；和
與所述寡核苷酸序列連接的至少兩種光度標記分子；
其中所述至少兩種光度標記分子的激發波長彼此在15nm以內；
其中與所述寡核苷酸連接的至少兩種光度標記分子彼此在3-60個
核苷酸以內；
其中所述寡核苷酸基本沒有內部二級結構；以及
其中當至少兩種所述光度標記分子被永久性彼此分開時，所述寡
核苷酸產生可檢測信號的增加。
2.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標記分
子是熒光分子。
3.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標記分
子中的至少一種選自BODIPY，具有離域正電荷的花青素染料，兼性花
青素染料，呫噸染料分子，非磺酸化花青素染料分子，CR110，CR6G，
TAMRA和ROX。
4.一種標記寡核苷酸的方法，包括以下步驟：
提供與靶多核苷酸序列雜交的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列
在其3′末端被封閉以阻止延伸入產物中；和將至少兩種光度標記分子連
接到所述寡核苷酸；其中所述至少兩種光度標記分子的激發波長彼此
在15nm以內；其中與所述寡核苷酸連接的至少兩種光度標記分子彼此
在3-60個核苷酸以內；
其中所述寡核苷酸基本沒有內部二級結構；以及
其中當至少兩種所述光度標記分子被永久性彼此分開時，所產生
的標記的寡核苷酸產生可檢測信號的增加。
5.一種標記寡核苷酸的試劑盒，包括：
適合雜交到靶多核苷酸序列的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列
在其3′末端被封閉以阻止延伸入產物中；和適合連接到所述寡核苷酸的
至少兩種光度標記分子，使得至少兩種光度標記分子彼此在3-60個核
苷酸以內連接到所述寡核苷酸；
其中所述至少兩種光度標記分子的激發波長彼此在15nm以內；
其中所述寡核苷酸基本沒有內部二級結構；以及
其中當至少兩種所述光度標記分子被永久性彼此分開時，所產生
的標記的寡核苷酸產生可檢測信號的增加。
6.一種使用標記的寡核苷酸的方法，包括以下步驟：
提供標記的寡核苷酸，
其中所述標記的寡核苷酸包括適合雜交到靶多核苷酸序列的寡核
苷酸序列，所述寡核苷酸序列在其3′末端被封閉以阻止延伸入產物中；
以及至少兩種光度標記分子；
其中所述至少兩種光度標記分子的激發波長彼此在15nm以內，
以及其中所述光度標記分子彼此在3-60個核苷酸以內連接到所述寡核
苷酸；
其中所述寡核苷酸基本沒有內部二級結構；以及
其中當至少兩種所述光度標記分子被永久性彼此分開時，所述寡
核苷酸產生可檢測信號的增加。
7.權利要求6的使用標記的寡核苷酸的方法，其中所述樣品選自
組織提取物，細胞提取物，體液，體外核酸合成反應和PCR反應混合
物。
8.權利要求6的使用標記的寡核苷酸的方法，其中所述標記的寡
核苷酸用于核酸擴增反應中，所述反應選自PCR，多重PCR，實時PCR，
定量PCR，和實時定量PCR。
9.權利要求6的使用標記的寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸
是用于鑒定所述樣品中存在核酸聚合物靶序列的探針。