本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌抗原的方法，該方法包括（1）制備抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠；（2）制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針；（3）將待檢樣品用PBST緩沖液溶解后，向溶解液中加入抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠，充分混合及反應(yīng)后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌，向得到的沉淀物中加入量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針，反應(yīng)后磁分離，以PBST緩沖液洗滌后，使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值。本發(fā)明具有準(zhǔn)確、快速、高靈敏度的檢測(cè)人A群鏈球菌的方法，其在人M1，3，5，6，24血清型A群鏈球菌的臨床診斷、病原學(xué)鑒別、流行病學(xué)調(diào)查等方面具有很高的實(shí)用價(jià)值。

1.一種用于制備基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌抗原的試劑盒的方
法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
1)抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠的制備：
1.1)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備
1.1.1)重組M-His融合蛋白的制備、純化：
1.1.1.1)對(duì)人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別獲取其N端型
特異性序列中含胞外抗原表位且不與其他抗原抗體起交叉反應(yīng)的的肽段；
1.1.1.2)找到步驟1.1.1.1)中所得到五個(gè)肽段一一對(duì)應(yīng)的基因編碼序列，按M1-M3-
M5-M6-M24的順序進(jìn)行序列拼接并根據(jù)大腸桿菌中密碼子的偏好性對(duì)該序列進(jìn)行密碼子優(yōu)
化，在上述經(jīng)密碼子優(yōu)化后的重組基因的序列的5’端及3’端引入酶切位點(diǎn)并化學(xué)合成全基
因序列，同時(shí)標(biāo)記記為m；
1.1.1.3)將步驟1.1.1.2)中所得到的m按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體pET-28a(+)
后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組M-His融合蛋白；所述重組M-His融合蛋白以可溶性表達(dá)方式存
在于菌體中；
1.1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.1.3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，以
Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0.2mg/mL后備用；
1.1.2)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備：
1.1.2.1)以步驟1.1.1.4)中所得到的重組M-His融合蛋白為完全抗原，分別免疫新西
蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球
菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清；所述兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清及鼠抗人A
群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清的間接ELISA效價(jià)均大于1×10⁵；所述間接ELISA是重
組M-His融合蛋白作為包被抗原為基礎(chǔ)；
1.1.2.2)采用Protein G親和層析柱分別純化兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗
血清及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG；
1.1.2.3)用凱基Bradford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟1.1.2.2)所得到的多克隆抗
體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為1mg/mL后備用；
1.2)免疫納米磁珠的包被：
1.2.1)取5mg磁珠，用1ml MES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移
除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄為內(nèi)核、粒徑為350nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液是質(zhì)
量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩沖液的pH＝6.0；所述納米磁分離器的磁
性強(qiáng)度是0.4T；
1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC溶液以及
用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以10-
40rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化1hr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用1ml步驟
1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
1.2.3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200μL步驟1.2.2)所得到的活化后的磁珠，
置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度
為50-300μg/ml的由步驟1.1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體
IgG溶液各1ml，室溫下以15rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離
后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀
中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量如下：8g/L
NaCl，0.2g/L KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，所述PBS緩沖液的pH＝7.4；
1.2.4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，
各用1ml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCl，0.2g/L
KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩沖液的pH＝7.4；
1.2.5)向各個(gè)離心管中分別加入1ml保存緩沖液重懸磁珠，置于4℃保存?zhèn)溆茫凰霰?br/>存緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，
0.3g/L NaN₃，5g/L牛血清白蛋白，所述保存緩沖液的pH＝7.4；
2)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針的制備：
其具體制備方法包括：
2.1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、600nmol N-羥基硫代琥珀酰
亞胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37℃反應(yīng)
30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及EDC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述磷酸
鹽緩沖液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述
磷酸鹽緩沖液的pH＝7.4；
2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入4-16nmol的步驟1.1)中所制備的鼠抗
人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇
PEG2000-NH₂至終濃度為1％，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)1h；
2.3)用0.2μm PES濾器過濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到50000MW
超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的
副產(chǎn)物；
2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗
滌液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心
15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于1ml磷酸鹽保存液中，置于4
℃保存?zhèn)溆茫凰隽姿猁}洗滌液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫
鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH＝7.4；所述磷酸鹽
保存液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛
血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH＝7.4；
3)PBST緩沖液的配制：
其具體配制方法包括：
取8g NaCl，0.2g KCl，0.24KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄，0.3g NaN₃，0.5ml Tween-20溶解于
800ml蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)整pH至7.4，再定容至1000ml；
4)質(zhì)控品的制備：
4.1)陽(yáng)性質(zhì)控品：陽(yáng)性質(zhì)控品由滅活的人M1型A群鏈球菌干燥結(jié)合到拭子上而成；
4.2)陰性質(zhì)控品：陰性質(zhì)控品即經(jīng)臨床確定為人A群鏈球菌陰性的人群的咽拭子；所述
人A群鏈球菌是人A群鏈球菌M1，3，5，6，24血清型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1.2.2)中，依次加入用步驟
1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液
配制的濃度是10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化1hr，置于納
米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用1ml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后
的磁珠；
所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為240μg/ml的由步驟
1.1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG溶液各1ml，室溫下以
15rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入1ml
含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液；
所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入12nmol的步驟1.1)中所
制備的鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述量子點(diǎn)是羧基化兩親聚合物修飾
的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄為內(nèi)核、殼材
料為聚苯乙烯、表面官能團(tuán)為羧基、粒徑為350nm的羧基磁珠。