本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株及構(gòu)建及發(fā)酵方法，構(gòu)建方法為：(1)獲得rib‐int段：(2)構(gòu)建pLR 01質(zhì)粒：(3)構(gòu)建EC?rib 01菌株：(4)構(gòu)建EC?Rib 02菌株：敲除步驟(3)所獲得的菌株EC?Rib 01基因組的糖酵解途徑中的pfkA基因和ED途徑中的edd基因及eda基因，得到菌株命名為EC?Rib 02。本發(fā)明的一種高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC?Rib 02核黃素產(chǎn)量達(dá)到10.47g/L以上，是目前大腸桿菌生產(chǎn)核黃素的最高產(chǎn)量；本發(fā)明的EC?Rib 02菌株的生產(chǎn)周期為60?80h，比現(xiàn)有常用的核黃素工程菌株生產(chǎn)周期短，節(jié)省能源。

1.一種高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟：
(1)獲得rib-int段：
以SEQ ID No.4所示rib-F和以SEQ ID No.5所示rib-R為引物，以p20C-EC10為模板，通
過(guò)PCR的方法，得到以SEQ ID No.1所示rib-int片段；
(2)構(gòu)建pLR 01質(zhì)粒：
以SEQ ID No.6所示Cat-F和以SEQ ID No.7所示Cat-R為引物，以pCas9為模板，通過(guò)
PCR擴(kuò)增，得到氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因命名為Cat基因，通過(guò)CEPC
組裝技術(shù)，將Cat基因和來(lái)自于pTKRed質(zhì)粒上的pSC101復(fù)制子組裝成質(zhì)粒pRB 01；將步驟
(1)獲得的rib-int片段通過(guò)酶切連接的方法，連接到pRB 01質(zhì)粒上面，得到質(zhì)粒命名為pLR
01；
(3)構(gòu)建EC-rib 01菌株：
將步驟(2)獲得的pLR 01質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli MG1655，得到菌株EC-Rib 01；
(4)構(gòu)建EC-Rib 02菌株：
敲除步驟(3)所獲得的菌株EC-Rib 01基因組的糖酵解途徑中的pfkA基因和ED途徑中
的edd基因及eda基因，得到菌株命名為EC-Rib 02。
2.權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建的高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02。
3.一種高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02的發(fā)酵方法，其特征是包括如下述步
驟：
(1)活化菌株：將權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02在LB固體
培養(yǎng)基中劃線(xiàn)，37℃培養(yǎng)10-20h，使菌株復(fù)壯；
(2)種子液的培養(yǎng)：將步驟(1)獲得的活化菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，32-37℃，180-
240rpm培養(yǎng)10-20h，然后將所得菌液按照體積比為1％-10％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基
中，32-37℃，180-240rpm培養(yǎng)10-20h，得到種子液；
(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：將步驟(2)所獲得的種子液按照體積比為1％-10％的比例接種到裝有
2-3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，加入氯霉素，使?jié)舛葹?-40ug/L，在35-37℃，pH＝6.5-7.3，
攪拌轉(zhuǎn)速300-800rpm的條件下發(fā)酵，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降到2g/L以下時(shí)，采用連續(xù)補(bǔ)
料的方式補(bǔ)充補(bǔ)料培養(yǎng)基；補(bǔ)料速度為0.1-0.5ml/min，當(dāng)溶氧水平降至10％以下時(shí)，增加
發(fā)酵罐的壓力至0.02-0.1MPa；當(dāng)發(fā)酵液中的核黃素濃度不再增加時(shí)，停止發(fā)酵；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基是以每1L計(jì)含有：葡萄糖5-30g，酵母抽提物1-15g，硫酸銨0.5-5g，硫
酸鎂0.05-1g，磷酸氫二鈉1-10g，磷酸二氫鉀1-10g，尿素1-10g，檸檬酸鐵銨10-100mg，氯化
鈣10-100mg，硫酸鋅0.01-0.1mg，氯化錳0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化鈷0.01-0.1mg，
硫酸銅0.01-0.1mg，氯化鎳0.01-0.1mg，鉬酸鈉0.01-0.1mg，余量為水；
所述補(bǔ)料培養(yǎng)基是以每1L計(jì)含有：葡萄糖500-800g，酵母抽提物5-20g，硫酸銨1-10g，
硫酸鎂0.1-5g，磷酸氫二鈉2-5g，磷酸二氫鉀2-15g，檸檬酸鐵銨10-100mg，氯化鈣10-
100mg，硫酸鋅0.01-0.1mg，氯化錳0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化鈷0.01-0.1mg，硫酸
銅0.01-0.1mg，氯化鎳0.01-0.1mg，鉬酸鈉0.01-0.1mg，余量為水。
4.權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)核黃素大腸桿菌工程菌株EC-Rib 02發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的用途。