本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)動(dòng)物體外細(xì)胞可逆永生化的載體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)動(dòng)物體外細(xì)胞可逆永生化的載體含有大腸桿菌復(fù)制起始區(qū)、氨芐青霉素抗性基因，以及表達(dá)盒1和表達(dá)盒2；所述表達(dá)盒1從上游到下游依次包括如下元件：P、hTERT、IVS、IRES、Hyg和SV40polyA；所述表達(dá)盒2從上游到下游依次包括如下元件：P、rtTA-Advanced和SV40polyA；所述表達(dá)盒1和所述表達(dá)盒2方向相反。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的環(huán)形載體，可實(shí)現(xiàn)對動(dòng)物細(xì)胞壽命的可逆調(diào)節(jié)，提高體外細(xì)胞遺傳操作的效率。本發(fā)明為動(dòng)物遺傳修飾或醫(yī)學(xué)細(xì)胞治療等應(yīng)用提供安全的細(xì)胞材料具有重要意義。

1.環(huán)形載體A，含有大腸桿菌復(fù)制起始區(qū)、氨芐青霉素抗性基因，以及表達(dá)盒1
和表達(dá)盒2，其特征在于：所述表達(dá)盒1從上游到下游依次包括如下元件：P_tight、hTERT、
IVS、IRES、Hyg^r和SV40polyA；所述表達(dá)盒2從上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、
rtTA-Advanced和SV40polyA；
所述大腸桿菌復(fù)制起始區(qū)的序列為序列表中序列1的第7611-8254位；所述氨芐
青霉素抗性基因的序列為序列表中序列1的第6604-7466位；
在所述表達(dá)盒1中，所述P_tight由TRE_mod和P_minCMV△組成；所述TRE_mod的序列如
序列表中序列1的第2-251位所示；所述P_minCMV△的序列如序列表中序列1的第257-316
位所示；所述hTERT的序列如序列表中序列1的第373-3829位所示；所述IVS的序
列如序列表中序列1的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列1的第
4223-4814位所示；所述Hygr的序列如序列表中序列1的第4838-5869位所示；所述
SV40polyA的序列如序列表中序列1的第6199-6399位所示；
在所述表達(dá)盒2中，所述P_CMV的序列如序列表中序列1的第10512-9921位所示；
所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列1的第9823-9077位所示；所述SV40polyA
的序列如序列表中序列1的第9054-8621位所示；
所述表達(dá)盒1的核苷酸序列為序列表中序列1的第2-6399位；
所述表達(dá)盒2的核苷酸序列為序列表中序列1的第10512-8621位；
所述環(huán)形載體A的核苷酸序列為序列表中序列1。
2.權(quán)利要求1所述的環(huán)形載體A的制備方法，包括如下步驟：
(1)用XhoⅠ酶切pTet-OnAdvanced質(zhì)粒，回收4.2kb片段；用XhoⅠ酶切
pTRE-Tight質(zhì)粒，回收0.6kb片段；將所述4.2kb片段與所述0.6kb片段反向連接，得
到重組載體，記作pTet-OnTight；
(2)用XbaⅠ和NheⅠ酶切pIREShyg3質(zhì)粒，回收2.3kb片段；用NheⅠ酶切所
述pTet-OnTight，回收線性載體骨架片段，記為片段A；將所述2.3kb片段與所述片
段A正向連接，得到重組載體，記作pTet-OnIREShyg；
(3)用EcoRⅠ酶切pLPC-hTERT質(zhì)粒，回收3.4kb片段；將所述3.4kb片段的
末端補(bǔ)平，得到平齊末端片段；用Eco47Ⅲ酶切所述pTet-OnIREShyg，回收線性載
體骨架片段，記為片段B；將所述平齊末端片段與所述片段B正向連接，得到重組載
體，記作pTet-OnhTERT；所述pTet-OnhTERT即為權(quán)利要求1中所述的環(huán)形載體A。
3.權(quán)利要求1所述的環(huán)形載體A在誘導(dǎo)動(dòng)物體外細(xì)胞可逆永生化中的應(yīng)用。
4.用于誘導(dǎo)動(dòng)物體外細(xì)胞可逆永生化的組合物，由權(quán)利要求1所述的環(huán)形載體A
和強(qiáng)力霉素組成。