本發(fā)明公開(kāi)了一種基于杜氏鹽藻代謝途徑的β-胡蘿卜素工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)從杜氏鹽藻中獲取相關(guān)基因的cDNA；(2)巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動(dòng)子的獲取；(3)p15A復(fù)制起始位點(diǎn)和氯霉素抗性基因的獲取；(4)構(gòu)建質(zhì)粒pDscrtB，質(zhì)粒pDscrtB轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后獲得β-胡蘿卜素工程菌。該菌株呈橙黃色，利用杜氏鹽藻的八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、ζ-胡蘿卜素脫氫酶和番茄紅素β環(huán)化酶來(lái)合成β-胡蘿卜素。該菌株在2YT培養(yǎng)基下37℃搖瓶培養(yǎng)24小時(shí)的β-胡蘿卜素的產(chǎn)率為2.6～3.2mg/g(細(xì)胞干重)。

1.基于杜氏鹽藻代謝途徑的β-胡蘿卜素工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，
包括如下步驟：
(1)從杜氏鹽藻中獲取相關(guān)基因的cDNA
從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的杜氏鹽藻(Dunaliella?salina)中提取總RNA，利用M-MLV
反轉(zhuǎn)錄酶以18個(gè)T的寡聚核苷酸為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得杜氏鹽藻的總cDNA；
以杜氏鹽藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游
引物P1：5’-CCGCTCGAGATGCCCTCCACTTCCGGTGC-3’和下游引物P2：
5’-ATCGATCGATCATCGATCTACTGTGGGCTCTTGG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到
杜氏鹽藻八氫番茄紅素合成酶Psy基因的cDNA；
以杜氏鹽藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游
引物P3：5’-ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA-3’和
下游引物P4：5’-ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA-3’
進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到杜氏鹽藻八氫番茄紅素脫氫酶Pds基因的cDNA；
以杜氏鹽藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游
引物P5：5’-CGACGCGTATGTTGGGACTCCATGGGATG-3’和下游引物P6：
5’-ATCGATCGCCCCTTAAGTCAAATGCTTGGAAGTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到
杜氏鹽藻ζ-胡蘿卜素脫氫酶Zds基因的cDNA；
以杜氏鹽藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游
引物P7：5’-CCCCTTAAGATGCTTCAAACACTGAGCGGTCG-3’和下游引物
P8：5’-ATCGATCGCTATTGCTGCTTTGCAGCACTTATTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得
到杜氏鹽藻番茄紅素β環(huán)化酶LycB基因的cDNA；
(2)巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動(dòng)子的獲取
從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巴氏杜氏藻(Dunaliella?bardawil)中提取基因組DNA，
以基因組DNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P9：
5’-GGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC-3’和下游引物P10：
5’-ATCGATCGCCGCTCGAGCCTACACACAGAGGAAGGAAAG-3’進(jìn)行PCR
擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動(dòng)子；
(3)p15A復(fù)制起始位點(diǎn)和氯霉素抗性基因的獲取
依次用內(nèi)切酶Cla?I在30℃下和Hind?III在37℃下對(duì)質(zhì)粒pVA838處理1h
后，純化并回收DNA片段；利用T4?DNA聚合酶對(duì)獲取的DNA片段進(jìn)行平
末端化，純化并回收DNA產(chǎn)物，利用T4DNA連接酶使DNA自身環(huán)化為質(zhì)
粒pcmp15A，質(zhì)粒pcmp15A轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia?coli)DH5α進(jìn)行增殖；
(4)質(zhì)粒的構(gòu)建
修飾處理并純化后的巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動(dòng)子DNA片
段在T4DNA連接酶作用下與經(jīng)純化和堿性磷酸酶處理過(guò)的質(zhì)粒pcmp15A的
DNA片段進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pDsA；
依次用內(nèi)切酶Xho?I和Pvu?I對(duì)質(zhì)粒pDsA和純化后的杜氏鹽藻八氫番茄
紅素合成酶Psy基因的cDNA在37℃下處理1h，純化并回收DNA片段；接
著兩者在T4DNA連接酶作用下形成質(zhì)粒pDsB；
依次用內(nèi)切酶Cla?I在30℃下和Pvu?I在37℃下對(duì)質(zhì)粒pDsB和純化后的
杜氏鹽藻八氫番茄紅素脫氫酶Pds基因的cDNA處理1h，純化并回收DNA片
段；接著兩者在T4DNA連接酶作用下形成質(zhì)粒pDsC；
依次用內(nèi)切酶Mlu?I和Pvu?I對(duì)質(zhì)粒pDsC和純化后的杜氏鹽藻ζ-胡蘿卜
素脫氫酶Zds基因的cDNA在37℃下處理1h，純化并回收DNA片段；接著
兩者在T4?DNA連接酶作用下形成質(zhì)粒pDscrtA；
依次用內(nèi)切酶Afl?II和Pvu?I對(duì)質(zhì)粒pDscrtA和純化后的杜氏鹽藻番茄紅
素β環(huán)化酶LycB基因的cDNA在37℃下處理1h，純化并回收DNA片段；接
著兩者在T4DNA連接酶作用下形成質(zhì)粒pDscrtB；質(zhì)粒pDscrtB轉(zhuǎn)化大腸桿
菌DH5α后獲得β-胡蘿卜素工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述質(zhì)粒pcmp15A
的純化和堿性磷酸酶處理是利用內(nèi)切酶EcoR?V對(duì)質(zhì)粒pcmp15A在37℃下處
理1h后，純化并回收DNA片段，再用堿性磷酸酶對(duì)回收的DNA片段進(jìn)行去
磷酸化，純化并回收DNA片段；
所述巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動(dòng)子的修飾處理是利用T4
DNA聚合酶對(duì)獲取的巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動(dòng)子進(jìn)行平末端
化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述反轉(zhuǎn)錄獲得
杜氏鹽藻的總cDNA的反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃，1h；70℃，15min。
4.一種由權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的方法制得的β-胡蘿卜素工程菌，
菌株為大腸桿菌(Escherichia?coli)DH5αpDscrtB，呈橙黃色。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的β-胡蘿卜素工程菌，其特征在于，該菌株利用
杜氏鹽藻的八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、ζ-胡蘿卜素脫氫酶和
番茄紅素β環(huán)化酶來(lái)合成β-胡蘿卜素。