本發(fā)明公開了一種小鼠胰島分離純化方法，采用自制的穿刺針由膽總管逆行穿刺并灌注膠原酶Ⅴ消化胰腺，使用一種密度梯度介質(zhì)離心結(jié)合手工挑選的方法分離純化胰島。雙硫腙染色鑒定胰島純度，AO/PI染色鑒定胰島活力。葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測胰島功能。采用此法在大規(guī)模的提取胰島時(shí)可以很大程度的節(jié)省時(shí)間，提高穿刺成功率，減少Ficoll400配制的時(shí)間及價(jià)格。同時(shí)，純化所得胰島產(chǎn)量、純度、活力及胰島功能都相對(duì)良好，是一種簡單快捷，廉價(jià)高效的小鼠胰島分離方法。

1.一種小鼠胰島分離純化方法，其特征在于：包括以下步驟：
（1）穿刺針的制備：將胰島素注射器從15U處剪開，剪刀修整斷口處，取出一個(gè)槍頭，在
酒精燈上燒灼該槍頭與移液槍相接的一端，然后迅速將該槍頭與胰島素注射器的斷口處進(jìn)
行耦合；燒灼另一個(gè)槍頭，用其溶解物對(duì)上述槍頭和胰島素注射器的耦合處進(jìn)行加固密封；
另取一根靜脈輸液針，將其針頭剪去，然后將靜脈輸液針的一端連接上述已經(jīng)燒灼耦合的
槍頭，另一端連接一個(gè)注射器，最后將胰島素注射器自帶的針頭斜面朝上彎曲60°；
（2）小鼠胰島的分離：將已死亡的小鼠血液充分放盡，噴灑酒精消毒后，行“V”型切口打
開腹腔，將空回腸及結(jié)腸翻轉(zhuǎn)至小鼠身體右側(cè)，充分暴露膽總管及十二指腸；在十二指腸處
結(jié)扎膽總管，然后在靠近肝臟肝總管和膽囊管匯合的“V”字型接口處用步驟（1）制得的穿刺
針進(jìn)行穿刺，穿刺成功后用動(dòng)脈夾夾閉穿刺針尾端膽總管避免膠原酶反流；將預(yù)冷的膠原
酶Ⅴ灌入胰腺，使其充分膨脹；隨后迅速取下灌注好的胰腺，置于含有膠原酶Ⅴ的離心管
中，于38℃恒溫水浴箱中靜止消化17min；消化結(jié)束后在多用途旋渦混合器上斡旋3次，每次
3秒；隨后，在離心管中加滿預(yù)冷的Hanks平衡鹽溶液終止消化；并于低速離心機(jī)上1000rpm
離心2min，沖洗2次；離心后棄上清，將沉淀組織用預(yù)冷的Hanks平衡鹽溶液重懸后40目無菌
金屬篩網(wǎng)過濾，收集過濾后的組織懸液；
（3）小鼠胰島的純化：將組織懸液再次離心后加入LSM并用滴管充分吹打混懸；將混懸
好的組織懸液于2000rpm條件下離心20min，離心結(jié)束后胰島存在于上清當(dāng)中；將上清轉(zhuǎn)移
至離心管，加入預(yù)冷的Hanks平衡鹽溶液后于1300rpm條件下離心5min，離心結(jié)束后胰島沉
于管底；將胰島加入Hanks平衡鹽溶液重懸后置于體式顯微鏡下進(jìn)一步手工挑選法進(jìn)行純
化；最后將純化的胰島移入含有完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
其中，平均每只小鼠胰腺加入7ml的LSM；
所述LSM為配制好并經(jīng)過過濾的淋巴細(xì)胞分離液，100ml的LSM中含有9.4g的泛影葡
胺及6.2g的Ficoll，其在20℃下的密度介于1.077-1.080之間。
2.如權(quán)利要求1所述的小鼠胰島分離純化方法，其特征在于：步驟（2）中，將5ml濃度為
1mg/ml預(yù)冷的膠原酶Ⅴ灌入胰腺。
3.如權(quán)利要求1所述的小鼠胰島分離純化方法，其特征在于：步驟（2）中，灌注好的胰腺
置于含有3ml濃度為1mg/ml的膠原酶Ⅴ的離心管。
4.如權(quán)利要求1所述的小鼠胰島分離純化方法，其特征在于：步驟（3）中，所述完全培養(yǎng)
基為含15%胎牛血清的RMPI1640。