本發明提供了一種高效的將人胚胎干細胞誘導分化為肝細胞的方法。該方法以腫瘤抑制因子P53及Wnt5a重組蛋白作為分化誘導劑，在分化培養初期采用低氧培養，之后在細胞發育不同時期添加包括甲胎蛋白（AFT）、胰島素等在內的肝細胞生長因子促進誘導分化。本發明也提供了由所述方法獲得的肝細胞，這些從人胚胎干細胞起源的肝細胞具有正常肝細胞的形態和亞細胞結構如毛細膽管等，表達肝細胞特異的蛋白質，如甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、細胞角蛋白18（CK18），而且還具有肝臟特異的糖原儲存功能。

1.一種胚胎干細胞定向分化為肝細胞的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： 1）
胚胎干細胞的體外培養，培養體系為含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基，其中添加0.1mmol/
L 2-巰基乙醇，25mM HEPES，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，1000U/ml重組小鼠白血病
抑制因子（LIF），培養條件為常氧、5%CO₂、37℃； 2）擬胚體的形成：培養體系為去除胚胎干
細胞培養體系中的LIF，同時將胎牛血清濃度調整為15%；將胚胎干細胞以3×10⁴-5×10⁴/ml
濃度接種于未經過促細胞黏附作用處理、瓶底光滑的玻璃培養瓶中搖動培養法，1天后便會
有大量的擬胚體生成，形成成熟擬胚體；將成熟的囊性擬胚體用胰蛋白酶消化為單個細胞，
培養條件為常氧、5%CO₂、37℃； 3）誘導分化階段Ⅰ：培養體系為誘導培養體系Ⅰ，培養條件為
4%O₂、5%CO₂、37℃，所述的誘導培養體系Ⅰ是將胎牛血清濃度調整為10%的擬胚體形成階段培
養體系，并加入腫瘤抑制因子P53，濃度是0.16U/ml，腫瘤抑制因子Wnt5a，濃度是100ng/ml，
培養時間為2天； 4）誘導分化階段Ⅱ：培養體系為誘導培養體系Ⅱ，培養條件為常氧、5%
CO₂、37℃，所述的誘導培養體系Ⅱ是將胎牛血清濃度調整為10%的擬胚體形成階段培養體
系，并加入20ng/ml甲胎蛋白（AFP），100ng/ml酸性纖維細胞生長因子（αFGF），30ng/ml人成
纖維細胞生長因子4（FGF4），培養時間為3天； 5）誘導分化階段Ⅲ：培養體系為誘導培養體
系Ⅲ，培養條件為常氧、5%CO₂、37℃，所述的誘導培養體系Ⅲ是將胎牛血清濃度調整為10%
的擬胚體形成階段培養體系，并加入20ng/ml肝細胞生長因子（HGF），10ng/ml制瘤素（OSM），
20ng/ml角質細胞生長因子（KGF），培養時間為3天； 6）誘導分化階段Ⅳ：培養體系為誘導培
養體系Ⅳ，培養條件為常氧、5%CO₂、37℃，所述的誘導培養體系Ⅳ是將胎牛血清濃度調整為
10%的擬胚體形成階段培養體系，并加入10^-7M地塞米松（DEX），0.8%二甲基亞砜（DMSO），5μg/
ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，培養時間為2天。