1.一種提取血液中核糖體新生肽鏈復(fù)合物的RNC固定劑，其特征在于所述RNC固定劑包
含如下含量的組分：
150μg/ml 放線酮，
30mM 二硫蘇糖醇，
0.55M 氯化銨，
30mM 檸檬酸鈉，
30mM 乙二胺四乙酸，
15mM 乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，
20μM 1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖，
0.010％甘油，
余量為水。
2.權(quán)利要求l所述的RNC固定劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
將各組分按照含量要求用超純水配置，然后調(diào)pH至5.6，用0.22μM濾膜過(guò)濾除菌，配制
完成后置于4℃保存。
3.一種血液中RNC-RNA的提取方法，該方法包括樣品預(yù)處理、RNC捕獲和RNC-RNA抽提三
個(gè)步驟，其中樣品預(yù)處理步驟采用權(quán)利要求1所述的RNC固定劑固定和RNC捕獲步驟用權(quán)利
要求1所述的RNC固定劑重懸細(xì)胞沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取方法，該方法包括如下步驟：
步驟1)樣品預(yù)處理，樣品預(yù)處理包括具體步驟：
A.全血樣品準(zhǔn)備
使用含EDTA抗凝管從手臂靜脈采集新鮮全血各兩份，體積為1mL，一份用于捕獲RNC，抽
提RNC-RNA，然后分離RNC-mRNAs，另一份用于生物學(xué)重復(fù)，兩份全血?jiǎng)?wù)必為同一樣品來(lái)源，
B.RNC固定及RNase抑制
采血完成后，立即對(duì)兩份新鮮全血都進(jìn)行核糖體復(fù)合物固定、裂解紅細(xì)胞、RNase抑制
以及終止所有酶活反應(yīng)，保留此刻RNA-RNA的原始狀態(tài)，
在采血30分鐘內(nèi)，按1∶1比例加入等體積RNC固定劑到抗凝管的全血中，確保蓋子嚴(yán)密，
輕輕顛倒五次混勻，血液混合液需靜置孵育20分鐘后，4℃可保存兩天，或者-20℃以下可保
存一個(gè)星期以上，
步驟2)RNC捕獲，RNC捕獲包括如下具體步驟：
A.分離細(xì)胞
1)將血液混合液轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，4℃低溫離心，6000g，2min，吸棄上清，
2)將細(xì)胞沉淀重懸于500μl RNC固定劑，輕柔吹打混勻后，4℃低溫離心，6000g，離心
2min，棄上清保留沉淀，
B.細(xì)胞清洗
加入預(yù)冷的0℃RNC清洗緩沖液使細(xì)胞重懸后，4℃低溫離心，2000g，5min，棄上清，清洗
兩次，保留沉淀，然后用槍頭將殘留液體吸干凈，置于冰上待用，
C.細(xì)胞冷凍保存
1)快速冷凍處理：將細(xì)胞重懸于1mL 0℃的RNC清洗緩沖液中，迅速加入液氮浸沒；
2)超低溫保存：將速凍后含細(xì)胞的離心管轉(zhuǎn)移到干冰或者低于-80℃超低溫冰箱中，進(jìn)
行儲(chǔ)存或運(yùn)輸，
3)解凍：儲(chǔ)存和運(yùn)輸后解凍，繼續(xù)進(jìn)行RNC提取，將細(xì)胞從超低溫環(huán)境迅速轉(zhuǎn)移至冰上，
直至完全解凍，在解凍過(guò)程中避免震動(dòng)，
D.細(xì)胞裂解
1)加入1mL RB裂解液，輕柔顛倒混勻，保證完全覆蓋，冰上放置30min，
2)將細(xì)胞裂解液在4℃離心機(jī)下進(jìn)行離心，16000g，10min，去除細(xì)胞碎片，保留上清，
E.密度梯度離心
1)將500μl上清液分別轉(zhuǎn)移到兩份已預(yù)冷且裝有2.7mL RB 30％sucrose的超離管上
層，
2)置于超速離心機(jī)4℃，110000rpm，45min，
3)離心結(jié)束后，迅速轉(zhuǎn)移超離管到冰上，小心吸走上清，透明的沉淀輕柔溶解于200μl
RB裂解液中，得到細(xì)胞RNC，用于后續(xù)進(jìn)行RNC-RNA抽提，
步驟3)RNC-RNA抽提，RNC-RNA抽提步驟包括如下具體步驟：
A.樣品裂解
RNC-RNA的抽提起始量為200μl樣品，加入1mL
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LS Reagent到捕獲后的RNC中，
輕柔顛倒5次，冰上放置10min，
B.氯仿萃取
1)將樣品裂解液加入200μl氯仿，裂解液：氯仿體積比為5∶1，顛倒5次，冰上放置5min，
2)置4℃冷凍離心機(jī)，12000g，15min，離心后轉(zhuǎn)移上清到新的1.5mL離心管中，
C.乙醇凍存及清洗
1)加入1mL 4℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇：上清體積比≥2.5∶1，充分顛倒混勻，置于-
80℃凍存1hour，
2)取出離心管，觀察無(wú)凝固后，置4℃冷凍離心機(jī)，12000g，20min，棄上清，保留白色沉
淀，初步得到RNA沉淀，
3)加入1mL 4℃預(yù)冷的70％乙醇，并用槍頭輕柔將沉淀吹散，顛倒混勻，離心12000g，
5min，沖洗兩次，將殘留的乙醇吸干，晾干3min，直至白色沉淀變半透明，
D.溶解RNA
加入50μl DEPC water溶解RNA，-80℃保存，
E.質(zhì)控
1)紫外分光檢測(cè)
2)瓊脂糖檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中RNC清洗緩沖液包含如下組分：
0.5mM 乙二胺四乙酸，
10mM 磷酸一氫鈉，
2mM 磷酸二氫鉀，
135mM 氯化鈉，
2.5mM 氯化鉀。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中RNC清洗緩沖液的制備方法為將各組分用超純水來(lái)
配制，調(diào)pH至7.5，121℃高壓滅菌60min，加入二硫蘇糖醇并調(diào)至終濃度為5mM DTT的體系，
配制完成后置于4℃保存。
7.根據(jù)權(quán)利4所述的方法，其中RB裂解液包含如下組分：
100μg/ml 放線酮，
30mM 蔗糖，
5mM 二硫蘇糖醇，
1％聚乙二醇辛基苯基醚，
20mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，
25mM 氯化鎂，
150mM 氯化鉀。
