本發明提供一種通過農桿菌注射滲透法將外源基因轉入菊花或近緣種進行瞬時表達的方法，該外源基因為GUS基因，由攜帶35s啟動子及終止子，小于10kb的過量表達載體質粒攜帶。主要步驟包括（1）植株的獲得（2）植物表達載體pORER1?2×35s:gus的構建（3）侵染液制備（4）菊花葉片的制備（5）葉片轉化（6）葉片轉化后培養（7）陽性轉化葉片檢測。本發明通過選擇合適的外植體、以農桿菌菌株作為易感菌株，通過利福平和卡那霉素選擇侵染菌體；同時，以P19與農桿菌混合培養制成侵染液，P19能有效抑制植物對外源導入載體表達的沉默效應，提高表達量，并且合理優化共培養條件，使該方法轉化時間縮短至45天左右，轉化效率達到60%以上。本發明方法為更有效地篩選和分析菊花基因功能、蛋白質定位及進一步獲得穩定轉化子提供了可能。

1.一種將外源基因轉入菊花進行瞬時表達的方法，其特征在于：該方法通過農桿菌注
射滲透法將含有GUS基因的瞬時表達載體轉入菊花‘優香’葉肉細胞中，經培養，使GUS基因
在葉片中瞬時表達；其中，瞬時表達載體為攜帶35s啟動子及終止子，小于10kb的過量表達
載體質粒；
具體方法包括如下步驟：
（1）植株的獲得：采用生根后30d-50d，有完全展開葉10-14片的菊花‘優香’扦插苗；選
取扦插苗中上部完全展開葉進行標記，以備注射；
（2）植物表達載體pORE R1-2×35s:gus的構建：設計引物分別為上游引物2×35S-Sac-
F :SEQ ID NO. 2，下游引物2×35S-Nhe-R: SEQ ID NO. 3，以pCAMBIA1301質粒DNA為模
板，用高保真酶，進行PCR擴增反應，PCR產物回收；PCR產物與Sac Ⅱ和Nhe I雙酶切后的
pORE R1載體連接，轉化TOP10感受態細胞，提取陽性質粒，植物表達載體pORE R1-2×35s:
gus構建成功；
（3）侵染液制備：將pORE R1-2×35s:gus轉入農桿菌EHA105中；挑取單克隆，PCR電泳檢
測，選取正確構建質粒的單克隆陽性農桿菌轉入YEB液體培養基中，過夜輕搖培養16～20h，
同時搖菌 P19；把搖好的兩種菌液進行常溫離心，去上清，收集菌體，分別用侵染緩沖液重
懸；將含有正確構建質粒的陽性農桿菌菌液與P19等體積混合，然后將混合菌液常溫輕搖培
養至少3小時；
（4）菊花葉片的制備：于葉片近軸端主葉脈中部兩側無葉脈處點刻傷或十字刻傷，傷口
只需透過葉表皮，不可穿透葉片；
（5）葉片轉化：以去除針頭的注射器吸取步驟（3）制備的侵染液，出水口對準刻傷處，緩
推注射器活塞，同時手指輕壓刻傷處對應的葉片遠軸端位置，以使侵染液滲透入葉片背面，
重復數次以使侵染液盡可能蔓延至整個葉片，標記下注射的葉片對應區域；
（6）葉片轉化后培養：將轉化后的扦插苗用保鮮膜封閉保濕，置于黑暗中培養1.5-2d，
然后再轉入光下培養 2-3 d，獲得轉化后的活體植株；
（7）陽性轉化葉片檢測：以X-Gluc染色反應液浸沒標記葉，過夜染色后脫色至透明狀
后，觀察葉片GUS染色狀況；設計GUS基因引物：上游引物GUS-RT-F: SEQ ID NO. 4，下游引
物GUS-RT-R: SEQ ID NO. 5，選取標記葉片提取RNA，并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴
增檢測陽性轉化葉片中GUS的表達。
2.權利要求1所述的將外源基因轉入菊花進行瞬時表達的方法，其特征在于，上述反應
步驟（2）中高保真酶采用TaKaRa的PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase；PCR產物以凝膠回收試
劑盒回收，采用熱激法轉化TOP10感受態細胞；PCR反應體系，50 μL含有：10×HS RCR
Buffer 5.0 μL，20 μmol·L^-1的2×35S-Sac-F、2×35S-Nhe-R引物各1.0 μL，2.5 mmol·L
^-1的dNTP mix 4.0 μL，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.4 μL，DNA模板 1 μL，ddH₂O
37.6 μL；反應程序：95 ℃預變性4 min，然后94 ℃解鏈30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延
伸1 min 30 sec，反應30個循環，72 ℃延伸10 min。
3.權利要求2所述的將外源基因轉入菊花進行瞬時表達的方法，其特征在于，步驟（3）
中植物表達載體pORE R1-2×35s:gus以凍融法轉化感受態的農桿菌，在50ml的YEB液體培
養基上培養；YEB培養基均添加有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素；農桿菌在YEB液體
培養基中過夜培養使OD600達到1.0-1.8，搖菌P19使OD600也達到1.0-1.8；菌體收集進行離
心時設置離心機轉速為4000rpm，離心10min；侵染緩沖液的配方為10 mM MES，100 μM AS，
50 mM MgCl₂水溶液，pH=5.6；侵染緩沖液調整菌液濃度使OD600在0.4或0.6或0.8或1.0；陽
性農桿菌菌液與P19等體積混合后以200rpm轉速28℃培養。