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基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表位的疫苗及其制備方法

  • 專利類型:發(fā)明專利
  • 有效期:不限
  • 發(fā)布日期:2021-09-30
  • 技術(shù)成熟度:可以量產(chǎn)
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態(tài)核實
  • 簽署交易協(xié)議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(shù)(專利)類型 發(fā)明專利
  • 申請?zhí)?專利號 CN200810232718.8 
  • 技術(shù)(專利)名稱 基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表位的疫苗及其制備方法 
  • 項目單位 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
  • 發(fā)明人 張英起,冉永剛,韓葦 
  • 行業(yè)類別 中藥材獲取-動植物采集
  • 技術(shù)成熟度 可以量產(chǎn)
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯(lián)系人 王希汝
  • 發(fā)布時間 2021-09-30  
  • 01

    項目簡介

    基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表位的疫苗及其制備方法,利用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)技術(shù)篩選出與人鼠嵌合單克隆抗體阿瓦斯汀(Avastin)特異親和的VEGF模擬表位,其氨基酸序列為:Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro;所述的模擬表位與VEGF的蛋白序列無同源性,在模擬表位的基礎(chǔ)上構(gòu)建在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)出針對VEGF分子自身抗體的多肽表位疫苗,提供以VEGF為靶點的腫瘤治療性疫苗開發(fā)和設(shè)計的策略VEGF是促進(jìn)血管生長作用最強(qiáng)的分子之一,是抗血管生成治療腫瘤的理想靶點,從而以主動免疫方式來替代或補(bǔ)充單抗被動免疫治療,為克服單抗治療缺陷打下基礎(chǔ)。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的模擬表位,其特征在于:利用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)技術(shù)篩選出與人鼠嵌合單克隆抗體阿瓦斯汀(Avastin)特異親和的VEGF模擬表位,其氨基酸序列為:Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。2.一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF模擬表位的制備方法,其特征在于,按以下步驟進(jìn)行:a)噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)十二肽庫的篩選首先菌體滴度的測定:噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)十二肽庫Ph.D.-12TM的噬菌體感染宿主后,加入20mg/mL的X-gal和50mg/mL的IPTG孵育過夜;觀察平板,計數(shù)藍(lán)色噬斑并乘以該平板中噬菌體樣品的稀釋倍數(shù),得到每10μl?Ph.D.-12TM噬菌體的滴度,以藍(lán)色噬斑形成單位表示(plaque?forming?units,pfu);其次生物淘洗:(1)接種噬菌體宿主細(xì)菌于含四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng);(2)以0.1mol/L的NaHCO3為溶劑配制pH為8.6、Avastin的濃度為100μg/mL的Avastin溶液,將Avastin溶液包被ELISA板孔過夜;將過夜后的96孔板倒扣在潔凈的紙巾上,除盡殘余液體,然后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%BSA的TBS溶液4℃孵育2h;再采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween?20的TBST洗滌6次,每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上,除盡殘余液體;所述TBS溶液為50mM的pH值為7.5的Tris-HCl溶液;(3)加入200μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween?20的TBST稀釋的含2x1011pfu的Ph.D.-12TM噬菌體溶液,室溫孵育1h;傾去液體,去除未結(jié)合的噬菌體,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween?20的TBST洗滌10次,每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙?巾上,除盡殘余液體;用100μL洗脫液洗脫結(jié)合的噬菌體,并加入15ml中和液;取1μL測滴度,剩余液體加入20mL處于對數(shù)生長早期的宿主培養(yǎng)物中,于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4.5h,得到擴(kuò)增的噬菌體;所述的洗脫液為含0.2mol/L的Glycine-HCl和pH值為2.2的10g/L的BSA的混合溶液;所述的中和液為pH值為9.1的1mol/L的Tris-HCl溶液;(4)將擴(kuò)增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液轉(zhuǎn)入離心管,4℃條件下離心10000rpm×10min;上清液轉(zhuǎn)入離心管,4℃條件下10000rpm×10min再離心一次;取80%的上清液轉(zhuǎn)入離心管,加入3ml的PEG8000/NaCl溶液4℃靜置過夜;次日,4℃離心10000rpm×15min,傾去離心上清液;用1mL的TBS重懸沉淀,于4℃離心10000rpm×5min,沉淀殘留的細(xì)胞;上清加入150ul的PEG-8000/NaCl冰浴1h,4℃離心10000rpm×15min,傾去上清,用200μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的NaN3的TBS重懸沉淀,離心10000rpm×1min;上清液即為擴(kuò)增好的Ph.D.-12TM噬菌體噬菌體洗脫液,1μL用于測滴度,余下的液體于4℃存放;所述的PEG8000/NaCl溶液含200mg/mL的PEG-8000和2.5M的NaCl;(5)按照上述第(2)步再包被ELISA板,進(jìn)行第二、三輪篩選;第二輪、第三輪篩選中Avastin濃度分別降至為50μg/mL、20μg/mL,分別加入2x1011pfu在第一輪、二輪篩選出的擴(kuò)增好的Ph.D.-12TM噬菌體,操作步驟按上述篩選步驟(1)-(4)進(jìn)行;TBST的Tween20濃度均提高至0.5%;第三輪的洗脫產(chǎn)物不需進(jìn)行擴(kuò)增,取1ul測定滴度;(6)從第三次篩選后噬菌體滴度測定中,菌斑數(shù)<100的平板上隨機(jī)挑取80個分隔良好噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增和純化,挑取的噬菌斑培養(yǎng)的時間不超過18h;所述的擴(kuò)增和純化:用無菌牙簽蘸取的80個分隔良好的藍(lán)色噬菌斑分別放入對數(shù)中期培養(yǎng)的宿主培養(yǎng)物中,37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4.5h后,12000rpm離心30s,將上清液?轉(zhuǎn)入新的離心管,12000rpm再離心30s,取80%的上清,即得擴(kuò)增的噬菌體懸浮液;b)特異性噬菌體篩選在上述選出的80個克隆中利用噬菌體ELISA進(jìn)一步挑選與Avastin高親和力的克隆;(1)以100mg/L的Avastin包被96孔酶聯(lián)板,每孔200μL,同時對每個Avastin孔設(shè)立白介素15(IL-15)單抗為陰性對照,4℃孵育過夜;(2)傾去包被液,加入封閉液4℃封閉2h;傾去封閉液,TBST清洗6次,每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上,除盡殘余液體;將80個純化的噬菌體按1×109/孔分別加入Avastin、IL-15單抗包被孔中室溫孵育2h;所述的封閉液含5mg/L的BSA和0.1mol/L的NaHCO3的混合溶液,該封閉液的pH為8.6;(3)TBST清洗6次,每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的1∶5000的小鼠抗M13噬菌體抗體100μL,室溫孵育1h;TBST清洗6次,鄰苯二胺(O-Phenylenediamine)顯色后測定A490nm處的吸光值;(4)根據(jù)A490nm處的吸光值,篩選出42個與Avastin有較高親和力而與其他對照親和力低的克隆進(jìn)行序列測定;篩選方法:噬菌體與Avastin結(jié)合后A490nm吸光值大于0.5,同時與對照組A490nm吸光值的比大于3;c)噬菌體呈現(xiàn)肽的序列測定(1)噬菌體單鏈DNA的提取:噬菌體克隆的擴(kuò)增后,取噬菌體培養(yǎng)上清,用單鏈DNA提取試劑盒進(jìn)行噬菌體單鏈DNA的提取,紫外定量其濃度大于100ng/μL;(2)Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列:以噬菌體單鏈DNA為模板,采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的測序引物,引物序列為ccctc?atagt?tagcg?taacg,在DNA自動測序儀上進(jìn)行自動測序;?(3)呈現(xiàn)隨機(jī)肽氨基酸序列的推導(dǎo):根據(jù)DNA測序結(jié)果,得出噬菌體所呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列,得出序列如下:Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。3.一種基于權(quán)利要求1所述的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的模擬表位的抗VEGF分子的疫苗,其特征在于,所述的模擬表位化學(xué)偶聯(lián)于蛋白載體鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole?limpet?hemocyanin,KLH),其連接方式為:KLH-Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。4.權(quán)利要求3所述的抗VEGF分子的疫苗的制備方法,其特征在于,采用以下步驟:(1)化學(xué)合成如權(quán)利要求1所述的模擬表位多肽Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro;(2)采用戊二醛法將合成多肽表位與KLH化學(xué)偶聯(lián):將KLH融于pH值為10的硼酸鹽緩沖液中震蕩,加入步驟(1)合成的模擬表位多肽,緩慢滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的戊二醛溶液,震蕩2小時,加入0.25毫升1mol/L的甘氨酸,30分鐘后終止反應(yīng);分離,將偶聯(lián)物在pH值為8.5的硼酸鹽緩沖液中4℃透析過夜,更換緩沖液繼續(xù)透析4小時以上得到純化的偶聯(lián)物;KLH與模擬表位多肽的質(zhì)量比為2∶3,KLH與戊二醛溶液的摩爾比為10∶3;(3)打點印跡(Dot?Blot)鑒定偶聯(lián)物,在打點印跡中能與Avastin結(jié)合的偶聯(lián)物即為人VEGF模擬表位構(gòu)建的多肽疫苗。?
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專利技術(shù)附圖

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