基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表位的疫苗及其制備方法，利用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)技術(shù)篩選出與人鼠嵌合單克隆抗體阿瓦斯汀(Avastin)特異親和的VEGF模擬表位，其氨基酸序列為：Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro；所述的模擬表位與VEGF的蛋白序列無同源性，在模擬表位的基礎(chǔ)上構(gòu)建在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)出針對VEGF分子自身抗體的多肽表位疫苗，提供以VEGF為靶點的腫瘤治療性疫苗開發(fā)和設(shè)計的策略VEGF是促進(jìn)血管生長作用最強(qiáng)的分子之一，是抗血管生成治療腫瘤的理想靶點，從而以主動免疫方式來替代或補(bǔ)充單抗被動免疫治療，為克服單抗治療缺陷打下基礎(chǔ)。

1.一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的模擬表位，其特征在于：利用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)技術(shù)篩選出與人鼠嵌合單克隆抗體阿瓦斯汀(Avastin)特異親和的VEGF模擬表位，其氨基酸序列為：Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。2.一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF模擬表位的制備方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行：a)噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)十二肽庫的篩選首先菌體滴度的測定：噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)十二肽庫Ph.D.-12^TM的噬菌體感染宿主后，加入20mg/mL的X-gal和50mg/mL的IPTG孵育過夜；觀察平板，計數(shù)藍(lán)色噬斑并乘以該平板中噬菌體樣品的稀釋倍數(shù)，得到每10μl?Ph.D.-12^TM噬菌體的滴度，以藍(lán)色噬斑形成單位表示(plaque?forming?units，pfu)；其次生物淘洗：(1)接種噬菌體宿主細(xì)菌于含四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)；(2)以0.1mol/L的NaHCO₃為溶劑配制pH為8.6、Avastin的濃度為100μg/mL的Avastin溶液，將Avastin溶液包被ELISA板孔過夜；將過夜后的96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體，然后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％BSA的TBS溶液4℃孵育2h；再采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的Tween?20的TBST洗滌6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體；所述TBS溶液為50mM的pH值為7.5的Tris-HCl溶液；(3)加入200μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的Tween?20的TBST稀釋的含2x10¹¹pfu的Ph.D.-12^TM噬菌體溶液，室溫孵育1h；傾去液體，去除未結(jié)合的噬菌體，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的Tween?20的TBST洗滌10次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙?巾上，除盡殘余液體；用100μL洗脫液洗脫結(jié)合的噬菌體，并加入15ml中和液；取1μL測滴度，剩余液體加入20mL處于對數(shù)生長早期的宿主培養(yǎng)物中，于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4.5h，得到擴(kuò)增的噬菌體；所述的洗脫液為含0.2mol/L的Glycine-HCl和pH值為2.2的10g/L的BSA的混合溶液；所述的中和液為pH值為9.1的1mol/L的Tris-HCl溶液；(4)將擴(kuò)增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液轉(zhuǎn)入離心管，4℃條件下離心10000rpm×10min；上清液轉(zhuǎn)入離心管，4℃條件下10000rpm×10min再離心一次；取80％的上清液轉(zhuǎn)入離心管，加入3ml的PEG8000/NaCl溶液4℃靜置過夜；次日，4℃離心10000rpm×15min，傾去離心上清液；用1mL的TBS重懸沉淀，于4℃離心10000rpm×5min，沉淀殘留的細(xì)胞；上清加入150ul的PEG-8000/NaCl冰浴1h，4℃離心10000rpm×15min，傾去上清，用200μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％的NaN₃的TBS重懸沉淀，離心10000rpm×1min；上清液即為擴(kuò)增好的Ph.D.-12^TM噬菌體噬菌體洗脫液，1μL用于測滴度，余下的液體于4℃存放；所述的PEG8000/NaCl溶液含200mg/mL的PEG-8000和2.5M的NaCl；(5)按照上述第(2)步再包被ELISA板，進(jìn)行第二、三輪篩選；第二輪、第三輪篩選中Avastin濃度分別降至為50μg/mL、20μg/mL，分別加入2x10¹¹pfu在第一輪、二輪篩選出的擴(kuò)增好的Ph.D.-12^TM噬菌體，操作步驟按上述篩選步驟(1)-(4)進(jìn)行；TBST的Tween20濃度均提高至0.5％；第三輪的洗脫產(chǎn)物不需進(jìn)行擴(kuò)增，取1ul測定滴度；(6)從第三次篩選后噬菌體滴度測定中，菌斑數(shù)＜100的平板上隨機(jī)挑取80個分隔良好噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增和純化，挑取的噬菌斑培養(yǎng)的時間不超過18h；所述的擴(kuò)增和純化：用無菌牙簽蘸取的80個分隔良好的藍(lán)色噬菌斑分別放入對數(shù)中期培養(yǎng)的宿主培養(yǎng)物中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4.5h后，12000rpm離心30s，將上清液?轉(zhuǎn)入新的離心管，12000rpm再離心30s，取80％的上清，即得擴(kuò)增的噬菌體懸浮液；b)特異性噬菌體篩選在上述選出的80個克隆中利用噬菌體ELISA進(jìn)一步挑選與Avastin高親和力的克隆；(1)以100mg/L的Avastin包被96孔酶聯(lián)板，每孔200μL，同時對每個Avastin孔設(shè)立白介素15(IL-15)單抗為陰性對照，4℃孵育過夜；(2)傾去包被液，加入封閉液4℃封閉2h；傾去封閉液，TBST清洗6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體；將80個純化的噬菌體按1×10⁹/孔分別加入Avastin、IL-15單抗包被孔中室溫孵育2h；所述的封閉液含5mg/L的BSA和0.1mol/L的NaHCO₃的混合溶液，該封閉液的pH為8.6；(3)TBST清洗6次，每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的1∶5000的小鼠抗M13噬菌體抗體100μL，室溫孵育1h；TBST清洗6次，鄰苯二胺(O-Phenylenediamine)顯色后測定A490nm處的吸光值；(4)根據(jù)A490nm處的吸光值，篩選出42個與Avastin有較高親和力而與其他對照親和力低的克隆進(jìn)行序列測定；篩選方法：噬菌體與Avastin結(jié)合后A490nm吸光值大于0.5，同時與對照組A490nm吸光值的比大于3；c)噬菌體呈現(xiàn)肽的序列測定(1)噬菌體單鏈DNA的提取：噬菌體克隆的擴(kuò)增后，取噬菌體培養(yǎng)上清，用單鏈DNA提取試劑盒進(jìn)行噬菌體單鏈DNA的提取，紫外定量其濃度大于100ng/μL；(2)Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列：以噬菌體單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的測序引物，引物序列為ccctc?atagt?tagcg?taacg，在DNA自動測序儀上進(jìn)行自動測序；?(3)呈現(xiàn)隨機(jī)肽氨基酸序列的推導(dǎo)：根據(jù)DNA測序結(jié)果，得出噬菌體所呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列，得出序列如下：Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。3.一種基于權(quán)利要求1所述的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的模擬表位的抗VEGF分子的疫苗，其特征在于，所述的模擬表位化學(xué)偶聯(lián)于蛋白載體鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole?limpet?hemocyanin，KLH)，其連接方式為：KLH-Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。4.權(quán)利要求3所述的抗VEGF分子的疫苗的制備方法，其特征在于，采用以下步驟：(1)化學(xué)合成如權(quán)利要求1所述的模擬表位多肽Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro；(2)采用戊二醛法將合成多肽表位與KLH化學(xué)偶聯(lián)：將KLH融于pH值為10的硼酸鹽緩沖液中震蕩，加入步驟(1)合成的模擬表位多肽，緩慢滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％的戊二醛溶液，震蕩2小時，加入0.25毫升1mol/L的甘氨酸，30分鐘后終止反應(yīng)；分離，將偶聯(lián)物在pH值為8.5的硼酸鹽緩沖液中4℃透析過夜，更換緩沖液繼續(xù)透析4小時以上得到純化的偶聯(lián)物；KLH與模擬表位多肽的質(zhì)量比為2∶3，KLH與戊二醛溶液的摩爾比為10∶3；(3)打點印跡(Dot?Blot)鑒定偶聯(lián)物，在打點印跡中能與Avastin結(jié)合的偶聯(lián)物即為人VEGF模擬表位構(gòu)建的多肽疫苗。?