本發(fā)明公開了三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒及其操作方法。本發(fā)明試劑盒包括：PBS預(yù)處理液、RNA快速提取液和檢測液。本發(fā)明采用了快速提取RNA的方法，加上預(yù)混檢測液、試劑一次性使用等設(shè)計，通過簡化的三步操作即可完成病毒檢測，檢測過程不易被污染，可操作性強。本發(fā)明設(shè)計的試劑盒檢測結(jié)果可視化，適用于無專業(yè)知識的基層工作人員，可用于防控石斑魚諾達病毒的流行，應(yīng)用前景廣泛，適合商業(yè)化生產(chǎn)。

1.一種三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：
PBS預(yù)處理液、RNA快速提取液和檢測液；
所述的PBS預(yù)處理液是pH7.2±0.2的PBS溶液；
所述的RNA快速提取液是Epicentre Biotechnologies公司QuickExtract^TM RNA
Extraction Solution型號的試劑；
所述的檢測液為環(huán)介導等溫擴增反應(yīng)液，其每20μl體系中含有：8-10U/μl Bst 2.0聚
合酶1μl，1-2U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，15-20U/μl RNase抑制劑1μl，1.0-2.0mM dNTPs 3.5μ
l，10×Amplification Buffer 2.5μl，6-8mM MgSO₄ 1.5μl，1M甜菜堿5μl，10×SYTO-9染料
0.5μl，0.2μM上游外引物F₃ 1μl，0.2μM下游外引物B₃ 1μl，1.6μM上游內(nèi)引物FIP 1μl，1.6μM
下游內(nèi)引物BIP 1μl；其中，10×Amplification Buffer含有200mM Tris-HCl、100mM(NH₄)
₂SO₄、500mM KCl、20mM MgSO₄和1％Tween 20，PH 8.8；
上游外引物F₃為：5’-GGTGCAGTCGTTGCCAAAT-3’，
下游外引物B₃為：5’-CGACATAGCACCGACACG-3’，
上游內(nèi)引物FIP為：5’-TCCTTTCCCGACGAGGTCCAGGTGGGAAAGCAGTACAGTCC-3’，
下游內(nèi)引物BIP為：5’-AGCGTCTCACGTCACCTGGTACCACATCGGTGTTGTTGC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測液所包含的組份已提前混
合；所述的RNA快速提取液是直接分裝而成的；所述的PBS預(yù)處理液、RNA快速提取液及檢測
液都為可直接使用的工作液。
3.一種非疾病的診斷和治療目的的三步法快速檢測石斑魚β諾達病毒的試劑盒的操作
方法，其特征在于，其是利用權(quán)利要求1所述的試劑盒進行檢測，具體包括以下步驟：第一
步，樣品預(yù)處理：將樣品于PBS預(yù)處理液中處理，制備成10³-10⁶個/mL的細胞懸浮液；第二步，
RNA快速提取：再將細胞懸浮液加入到RNA快速提取液中進行病毒RNA提取得到總RNA溶液；
第三步，病毒檢測：然后將總RNA溶液加入到檢測液中，置于63-68℃的水浴下保溫1-1.5h；
若檢測液顏色發(fā)生改變，則說明樣品中含有β諾達病毒；若檢測液顏色未發(fā)生改變，則說明
樣品中不含有β諾達病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的操作方法，其特征在于，所述的將細胞懸浮液加入到RNA快速
提取液中是取8～15微升的10³-10⁶個/mL的細胞懸浮液加入到100-200μl的RNA快速提取液
中，并充分振蕩1-3min，制成總RNA溶液；所述的將總RNA溶液加入到檢測液中是吸取2-6微
升總RNA溶液加入20μl的檢測液中。