1.中華鱉四個種群的種質鑒定PCR檢測方法，其特性在于該方法包
括以下步驟：
步驟(1).總DNA的提取：
按照常規方法提取待測樣品的DNA，然后將提取到的DNA稀釋至
50～150ng/μl，保存于-20℃；
步驟(2).PCR擴增：
以步驟(1)提取到的DNA為模板，分別用3對擴增引物SEQ?ID?No.1
/SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.2/SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.3/SEQ?ID?No.6
進行PCR擴增，同時也對已知的中華鱉太湖種群、臺灣種群、黃河種群
和中華鱉日本品系新品種對照DNA模板進行PCR擴增；
所述的PCR擴增反應體系為50ul由25μl的2×Taq?PCR預混液、
1μl上游引物、1μl對應的下游引物、1μl模板和余量的ddH2O組成；
所述的2×Taq?PCR預混液為0.1U/μl?Taq酶、500uM?dNTP、2×PCR
緩沖液的混合液；
所述的PCR擴增反應條件為：95℃預變性3min，95℃變性30s，55～
57℃退火30s，72℃延伸1min，反應進行35個循環，最后72℃延伸10min；
步驟(3).酶切反應：
對擴增引物SEQ?ID?No.1/SEQ?ID?No.4的擴增產物進行Bgl?I酶
切，所用的酶切緩沖液為10×酶切緩沖液A；對擴增引物SEQ?ID?No.2/SEQ?
ID?No.5的擴增產物進行Hpa?II酶切，所用的酶切緩沖液為10×酶切
緩沖液B；對擴增引物SEQ?ID?No.3/SEQ?ID?No.6的擴增產物進行Cla?I
酶切，所用的酶切緩沖液為10×酶切緩沖液C；
所述的酶切反應體系為25μl由15μl步驟(2)某一擴增引物擴增待
測DNA得到的擴增產物或對照DNA模板擴增得到的擴增產物、2.5μl?10
×酶切緩沖液、0.25μl?BSA、5U限制性內切酶和余量的ddH2O組成；
所述的酶切反應條件為酶切反應體系在37℃下孵育4小時以上；
所述10×酶切緩沖液A為1M?NaCl、500mM?Tris-HCl、100mM?MgCl2、
10mM?DTT的混合液，pH值為7.9；
所述10×酶切緩沖液B為100mM?Bis?Tris?Propane-HCl、100mM?
MgCl2、10mM?DTT的混合液，pH值為7.0；
所述10×酶切緩沖液C為500mM?KAc、200mM?Tris-Ac、100mM?
Mg(Ac)2、10mM?DTT的混合液；
步驟(4).標準電泳圖譜的建立：
將對照DNA模板擴增得到的擴增產物的酶切產物進行1.5﹪瓊脂糖
凝膠電泳檢測，構建每種中華鱉的標準PCR-RFLP圖譜；
步驟(5).待測樣品的種質來源鑒定：
將待測樣品的三種擴增引物擴增得到的擴增產物的酶切結果進行
瓊脂糖凝膠電泳，引物對SEQ?ID?No.1/SEQ?ID?No.4的擴增產物經Bgl?I
酶切后，在黃河種群中出現長度為1450bp的一條帶，而其他種群中出
現618bp和832bp的兩條帶；引物對SEQ?ID?No.2/SEQ?ID?No.5的擴增
產物經Hpa?II酶切后，在黃河種群和臺灣種群中出現長度為715bp的
一條帶，在日本品系新品種和太湖種群中出現330bp和385bp的兩條帶；
SEQ?ID?No.3/SEQ?ID?No.6的擴增產物經Cla?I酶切后，在日本品系新
品種中出現長度為980的一條帶，在其他種群中出現長度為481bp和
499bp的兩條帶；將電泳結果與標準電泳圖譜進行比對，得出結果。
2.如權利要求1所述的中華鱉四個種群的種質鑒定PCR檢測方法所
用的引物組，其特征在于該引物組包括3對擴增引物SEQ?ID?No.1/SEQ?
ID?No.4、SEQ?ID?No.2/SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.3/SEQ?ID?No.6，具
體是：
SEQ?ID?No.1：5’-GAACCCCTATCACGAAAACG-3’，濃度為10pM；
SEQ?ID?No.2：5’-TACAATATTACTCACAGACCGAAAC-3’，濃度為10pM；
SEQ?ID?No.3：5’-ATAGGACAACCACGATTTCAGC-3’，濃度為10pM；
SEQ?ID?No.4：5’-GCTATTTTTACGGCGGTTTTTG-3’，濃度為10pM；
SEQ?ID?No.5：5’-TGGGTAGTCAGAATAGCGTCGT-3’，濃度為10pM；
SEQ?ID?No.6：5’-TATTAGTGTAGCTTCTGGTCCCTC-3’，濃度為10pM。
3.如權利要求1所述的中華鱉四個種群的種質鑒定PCR檢測方法所
用的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括pH值為8.3的2×Taq?PCR預
混液、濃度為5U/μl的限制性內切酶Bgl?I及對應的10×酶切緩沖液A、
濃度為5U/μl的限制性內切酶Hpa?II及對應的10×酶切緩沖液B、濃
度為5U/μl的限制性內切酶Cla?I及對應的10×酶切緩沖液C、濃度為
10mg/ml的牛血清白蛋白BSA、4種已知來源中華鱉的對照DNA模板和濃
度為10pM的3對擴增引物；
所述的2×Taq?PCR預混液為0.1U/μl?Taq酶、500uM?dNTP、2×PCR
緩沖液的混合液；
所述10×酶切緩沖液A為1M?NaCl、500mM?Tris-HCl、100mM?MgCl2、
10mM?DTT的混合液，pH值為7.9；
所述10×酶切緩沖液B為100mM?Bis?Tris?Propane-HCl、100mM?
MgCl2、10mM?DTT的混合液，pH值為7.0；
所述10×酶切緩沖液C為500mM?KAc、200mM?Tris-Ac、100mM?
Mg(Ac)2、10mM?DTT的混合液；
所述的3對擴增引物分別為SEQ?ID?No.1/SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?
No.2/SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.3/SEQ?ID?No.6所示。
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