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番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-19
  • 技術成熟度:通過中試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201310453155.6 
  • 技術(專利)名稱 番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法 
  • 項目單位 甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心
  • 發明人 文朝慧,王軍平,周小平,李儒,劉雯 
  • 行業類別 中藥材獲取-非動植物采選
  • 技術成熟度 通過中試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 鄭俊燕
  • 發布時間 2021-12-19  
  • 01

    項目簡介

    本發明屬于生物技術領域,涉及一種番茄病害的檢測方法,主要針對番茄的三種重要種傳病原馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和煙草環斑病毒的同時檢測。一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒,番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒,其主要特點在于包括以下組分:RT-PCR buffer;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上下游引物,鳳果花葉病毒PepMV上下游引物,煙草環斑病毒TRSV上下游引物;反轉錄酶及DNA聚合酶Mix;無RNA酶的去離子水;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒和煙草環斑病毒無侵染活性的陽性對照。本發明的優點是能同時檢測番茄3種重要種傳病原,快速準確,避免了常規PCR檢測的重復操作。
    展開
  • 02

    說明書

    1.一種番茄種傳病原多重PCR檢測試劑盒,番茄種傳病原為馬鈴薯紡錘
    塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒,其特征在于包括以下組分:
    RT-PCR?buffer,2×RT-PCR?buffer,100-250μL;RT-PCR擴增引物為
    馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物,濃度為10μmol/L,10-30μL;馬
    鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd下游引物,濃度為10μmol/L,10-30μL;鳳果
    花葉病毒PepMV上游引物,濃度為10μmol/L,10-30μL;鳳果花葉病毒PepMV
    下游引物,濃度為10μmol/L,10-30μL;煙草環斑病毒TRSV上游引物,濃
    度為10μmol/L,10-30μL;煙草環斑病毒TRSV下游引物,濃度為10μmol/L,
    10-30μL;反轉錄酶及DNA聚合酶Mix,20μL;無RNA酶的去離子水,100
    μL-1mL;陽性對照,馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd、鳳果花葉病毒PepMV
    和煙草環斑病毒TRSV無侵染活性的陽性對照各20-60μL;所述的RT-PCR
    擴增引物為:
    馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物為:5′
    -ATTCCCGCCGAAACAGG-3′;
    PSTVd下游引物為:5′-CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3′;鳳果花葉
    病毒PepMV上游引物為:5′-ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3′;PepMV
    下游引物為:5′-AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3′;煙草環斑病毒
    TRSV上游引物為:5′-CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3′;TRSV下游引物
    為:5′-ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3′。
    2.一種番茄種傳病原多重PCR檢測方法,其特征在于包括有:
    1)總核酸提?。?br/>2)RT-PCR反應體系為50μL,其中2×RT-PCR?buffer?25μL,RT/Taq?
    Mix1.0-2.0μL,馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd上游引物5′-
    ATTCCCGCCGAAACAGG-3′10μmol/L?0.6-1.6μL,PSTVd下游引物5′-
    CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3′10μmol/L?0.6-1.6μL;鳳果花葉病
    毒PepMV上游引物5′-ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3′10μmol/L?0.2-
    1.0μL;PepMV下游引物為:5′-AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3′10μ?
    mol/L?0.2-1.0μL;煙草環斑病毒TRSV上游引物5′-
    CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3′10μmol/L?0.2-1.0μL;TRSV下游引物5′
    -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3′10μmol/L?0.2-1.0μL;總RNA模板2.5-
    8μL,滅菌去離子水補足反應總體積;
    3)RT-PCR反應條件為:
    cDNA合成:50℃30min,1個循環;
    PCR擴增:94℃預變性3min;94℃變性30s,50℃退火45s,72℃
    延伸1min,35個循環;最后72℃延伸10min;
    4)RT-PCR擴增產物電泳檢測:用TAE電泳緩沖液制備1.5%瓊脂糖凝
    膠,在室溫下進行水平電泳;加10μL
    PCR擴增產物,以健康番茄總核酸的反轉錄PCR產物為陰性對照,以DL?1000
    Marker為標準分子量;100V/80mA下電泳30min,用SYBR?Safe代替EB染色,
    用凝膠成像系統觀察并拍照,馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴增產物為一條163bp
    的條帶,鳳果花葉病毒擴增產物為一條625bp的條帶,煙草環斑病毒擴增產
    物為一條348bp的條帶。
    3.如權利要求2所述的番茄種傳病原多重PCR檢測方法,其特征在于所
    述的核酸提取包括有如下步驟:
    (1)取感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、鳳果花葉病毒或煙草環斑病毒的
    番茄葉片;稱取0.1g感染病毒樣品組織倒在潔凈的研缽內,加液氮研磨
    成粉末狀;
    (2)移入1.5mL離心管中,然后加入1mL的TRIzol,劇烈振蕩3min
    以上;
    (3)在4℃下,12?000rpm離心10min以除去不溶成分,將上清
    液轉入另一新的1.5mL離心管中;
    (4)在室溫下靜置5min,加0.2mL氯仿/mL?TRIzol,劇烈振蕩15s,
    然后在室溫下靜置15min,再于4℃、12?000rpm的條件下離心15min;
    (5)將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中,加0.5mL異丙醇/mL
    TRIzol,上下顛倒混勻,室溫靜置15min;
    (6)4℃、12?000rpm離心10min;
    (7)棄上清,加入75%的乙醇洗滌沉淀,然后4℃、7?500rpm離心
    2min,棄乙醇;
    (8)沉淀在室溫下干燥10min或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min,加
    入30μL無RNase水溶解,-70℃保存備用。
    展開

專利技術附圖

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