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一種用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的培養基及方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-12-08
  • 技術成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201611020414.6 
  • 技術(專利)名稱 一種用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的培養基及方法 
  • 項目單位 四川農業大學
  • 發明人 鄒雪,楊蘭淅,唐曉,邸雪妮,鄧孟勝,王西瑤,黃雪麗,余金龍,李立芹,倪甦,劉帆,余麗萍,彭潔 
  • 行業類別 中藥材獲取-動植物采集
  • 技術成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 鄭銳濱
  • 發布時間 2021-12-08  
  • 01

    項目簡介

    本發明涉及一種用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的培養基,所述培養基包括1.0mg/L的6?BA、0.2mg/L的TDZ、0.05mg/L的2,4?D,以及0.1mg/L的GA3;還涉及一種用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,包括步驟:(1)預培養;(2)農桿菌侵染和共培養;(3)篩選培養;以及(4)生根培養。本發明以取材廣泛易得的馬鈴薯試管苗莖段為外植體,建立莖段的體胚高效再生及遺傳轉化的培養基,可獲得90%~100%的芽分化效率,同時改進培養方式、調節農桿菌侵染濃度,提高了轉化和篩選效率,經過30d左右的篩選即可獲得大量轉基因株系,整體所需周期大大縮短。
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  • 02

    說明書

    1.一種用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,運用馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的培養基,所述培養基包括1.0 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的TDZ、0.05 mg/L的2,4-D,以及0.1 mg/L的GA3,所述培養基包括預/共培養基、固體篩選培養基及液體篩選培養基,所述方法包括:(1)預培養,剪取馬鈴薯試管苗莖段,去除腋芽并剪成0.5~1cm作為外植體接種在預/共培養基中預培養2~4d;(2)農桿菌侵染和共培養,將所述莖段于一農桿菌菌液中侵染3~5min,用無菌水清洗后移至無菌濾紙上去掉多余水分,再接入墊有2~3層無菌濾紙的預/共培養基中,24℃黑暗共培養36h;(3)篩選培養,共培養后將所述莖段放入含100 mg/L Cef的無菌水中清洗3~4遍,吸掉多余水分后轉入一固體篩選培養基中培養7d~14d,去除因農桿菌而過度生長的致死、污染和完全白化外植體,然后換入液體篩選培養基中繼續培養,培養20d~40d后可分化出大量芽;(4)生根培養,剪下分化出的芽接入一生根篩選培養基中培養10d。2.如權利要求1所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,所述預/共培養基的組成為:MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LTDZ+0.05 mg/L2,4-D+0.1mg/LGA3+3%蔗糖+0.6%瓊脂;所述固體篩選培養基的組成為:MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LTDZ+0.05 mg/L2,4-D+0.1mg/LGA3+3%蔗糖+0.6%瓊脂+50 mg/L Kan+ 100 mg/L Cef+250 mg/L Car;所述液體篩選培養基的組成為:MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LTDZ+0.05 mg/L2,4-D+0.1mg/LGA3+3%蔗糖+50 mg/L Kan+200 mg/L Cef+500 mg/L Car。3.如權利要求1所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,所述步驟(1)前還包括馬鈴薯試管苗擴繁的步驟:剪取帶1~2個腋芽的馬鈴薯試管苗莖段接入含MS+3%蔗糖+0.6%瓊脂的培養基中,調節pH為5.9~6.0,16h光/8h暗,光強為60 μmol m-2s-1,溫度為22±1℃,繁殖系數為3~4倍,每隔10d~14d剪接擴繁1次。4.如權利要求1所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,所述步驟(2)前還包括制備農桿菌菌液的步驟:挑取含目的基因AtGAPC2的農桿菌GV3101單菌落,接種至液體YEB中過夜培養,然后按1:200的比例稀釋菌液于液體YEB中,培養至OD600=0.3~0.4,取菌液于4000rpm下離心5min然后去上清,再加入等量的液體MS重懸菌體備用。5.如權利要求4所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,所述YEB含50 mg/L Kan、100 mg/L Rif及25 mg/L Gen。6.如權利要求1所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,所述生根篩選培養基含MS、3%蔗糖、0.6%瓊脂、50 mg/L Kan、100 mg/L Cef及250 mg/LCar。7.如權利要求1所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,所述步驟(4)之后還包括PCR檢測陽性率的步驟:采用CTAB法提取生根篩選培養基培養后能正常長根的株系的葉片基因組DNA,PCR擴增反應后采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測目的條帶,確性陽性株系。8.如權利要求7所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,PCR擴增目的基因AtGAPC2的引物序列為:P1: 5’ TCTAGA-ATGGCTGACAAGAAGATCAGAAT3’,P2: 5’ CCCGGG-TTAGGCCTTTGACATGTGAACG3’。9.如權利要求7所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,PCR擴增反應體系含有8μL ddH2O,10μL 2×Mix,0.5μL P1(10 μM),0.5μL P2(10μM),以及1.0μL DNA模板。10.如權利要求7所述的用于馬鈴薯莖段體胚高效再生及遺傳轉化的方法,其特征在于,PCR擴增反應條件為:94℃預變性5min;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸60s,30個循環;72℃延伸10min。
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