本發明屬于生物醫藥領域，公開了一種人正常陰道上皮3D分化培養物模型的構建方法與用途。提供2D生長培養基，獲得分離培養自女性陰道癌旁正常組織的正常陰道上皮細胞，未導入任何外源基因，具有正常分化的生理功能。其構建人正常分化陰道上皮3D模型的方法為：2D培養基重懸單細胞，接種到氣?液培養裝置中，生長培養基更換為分化培養基培養14?21天。人陰道上皮3D氣?液培養物分化完全后，接種HSV?2病毒液，獲得HSV?2病毒感染3D模型。這兩種3D模型可用于人正常生殖道上皮的生理學研究和藥物毒性安全性評價，HSV?2病毒感染性疾病、性傳播病原體感染性疾病的發病機理研究，以及抗病毒藥物的研發。

1.一種人正常陰道上皮3D分化培養物模型的構建方法，包括如下步驟：A、人正常陰道上皮細胞原代分離培養：（1）在病人或病人監護人知情同意的情況下，收集陰道癌患者手術切除的癌旁正常組織樣品；(2) 消化液的配制：含膠原酶和分散酶均為0.2 mg/mL的原代上皮細胞生長培養基；其中，原代上皮細胞生長2D培養基的成分包括：DMEM與Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按體積比3:1混合的培養基，同時添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲狀腺氨酸、0.4-0.65％胰島素鐵硒傳遞蛋白、4-6μg/ml鐵傳遞蛋白、9-11ng/mL表皮生長因子、0.3-0.5μg/mL氫化可的松、35-45μg/mL慶大霉素、45-55nM calpeptin、35-45ng/ml重組人IL-1RA，及3μg/ml重組人R-Spondin-1；（3）用95～100%的乙醇洗分離的組織樣品1次，再用0.01M，pH 7.4的PBS洗2次，然后將組織放入含冰上預冷PBS的無菌培養皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織中殘留的脂肪；（4）將正常陰道組織樣品放入10倍于組織樣品體積的含步驟（2）所配制消化液的無菌培養皿中，37℃消化1～3小時；（5）將消化后的組織低速離心1000 rpm 5分鐘，去除上清；（6）將細胞沉淀重懸于2-5 mL的0.25%胰酶-EDTA中，置于冰上1小時或室溫消化10分鐘；（7）然后加入10 mL含10% FBS的DMEM培養基，低速1000 rmp離心5分鐘，盡量將上清去除干凈；（8）加入2 mL37℃溫水浴的5 mg/mL分散酶和200μL 的1 mg/mL DNase I，用無菌的P1000一次性塑料槍頭反復吹打樣品1分鐘；（9）加入10 mL含10% FBS的DMEM，用40～70 μm孔徑的過濾器過濾細胞懸液，收集過濾后的細胞懸液，低速1000 rmp離心 5分鐘，去除上清；（10）重懸細胞沉淀于2D培養基中，接種于T25或T75的培養瓶培養，培養條件是37℃、5%CO₂；B、人正常陰道上皮細胞的傳代培養：（1）當在T25或T75的培養瓶中培養的人正常陰道上皮細胞增殖至70～90%豐度時，用1×0.01M，pH 7.4 PBS洗滌細胞三次，再用0.05% 胰酶-EDTA消化單層細胞2～5分鐘；（2）加入10 mL DMEM中和消化反應1～2分種；（3）1000 rmp離心5分鐘，棄上清；（4）以1:2，1:3，1:4或1:5比例重懸細胞沉淀于2D培養基，接種于培養瓶培養，培養條件是37℃、5% CO₂得到人正常陰道上皮細胞；（5）必要時可將1×10⁶上皮細胞重懸于1-2 mL的含90%胎牛血清和10% DMSO的細胞凍存液中，儲存于液氮中備用；C、人正常陰道上皮的氣-液3D培養：（1）將0.4μm的Millipore公司的12 mm Millicell PCF insert， 放入六孔板中，每孔最多放三個inserts；（2）用400μl 2D培養基重懸5x10⁵個的人陰道上皮細胞，然后接種到每個insert中；（3）每個孔板內部即insert外圍加入2ml的2D培養基；（4）將放有insert的六孔板放入濕熱培養箱中，37℃，5%CO₂培養時長為48小時；（5）將insert內部及外部中的培養基更換為3D分化培養基；3D分化培養基的配制：DMEM與F12按體積比1:1混合的培養基，同時添加0.5-1.2 μM胰島素、0.05-0.2μM鐵傳遞蛋白，0.05-0.15μM氫化可的松，0.005-0.015μM三碘甲狀腺氨酸，1-4μM腎上腺素，0.1-1ng/mL表皮生長因子，2 x 10^–8 -8 x 10^–8 M視黃酸，0.1-1 μM磷酸乙醇胺，0.1-1 μM氨基乙醇，1-5μM硫酸鋅，100 U/mL青霉素G硫酸，100μg/mL鏈霉素硫酸鹽，0.5-1.5 mM氯化鈣；（6）將放有insert的培養皿放入濕熱培養箱中，培養15-17小時，使insert內部的細胞與細胞之間形成緊密連接；（7）移除insert內部及外部所有的培養基，外部的培養皿中加入3D分化培養基，開始分化培養；（8）在濕熱培養箱中培養陰道上皮細胞14-21天，培養條件為37℃，5%CO_2,每2-3天更換insert外圍的培養基。2.根據權利要求1所述的人正常陰道上皮3D分化培養物模型的構建方法，其特征在于，步驟A（2）所述的2D培養基的配制為：DMEM與Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按體積比3:1混合的培養基，同時添加5％胎牛血清、2nM三碘甲狀腺氨酸、0.5％胰島素鐵硒傳遞蛋白、5μg/ml鐵傳遞蛋白、10ng/mL表皮生長因子、0.4μg/mL氫化可的松、40μg/mL慶大霉素、50nMcalpeptin、40ng/ml重組人IL-1RA，及3μg/ml重組人R-Spondin-1。3.根據權利要求1所述的人正常陰道上皮3D分化培養物模型的構建方法，其特征在于，步驟C（5）所述的3D分化培養基的配制為：DMEM與F12按體積比1:1混合的培養基，同時添加0.87 μM胰島素、0.125μM鐵傳遞蛋白，0.1μM氫化可的松，0.01μM三碘甲狀腺氨酸，2.7μM腎上腺素，0.50ng/mL表皮生長因子，5 x 10^–8 M視黃酸，0.5 μM磷酸乙醇胺，0.5 μM氨基乙醇，3.0μM硫酸鋅，100 U/mL青霉素G硫酸，100μg/mL鏈霉素硫酸鹽。