1.一種納塔櫟體細胞胚胎的發生方法,其特征在于:包括以下步驟:?(1)選材:選取9年生納塔櫟優選單株的當年生萌條,將其剪成4~6cm的帶芽小段;?(2)對帶芽小段外植體進行消毒處理;?(3)芽誘導培養:在無菌條件下,將步驟(2)中的外植體用剪刀去除莖段頭尾氧化變黑部分,分清形態學上、下端,剪成長1.5~3cm的Y字型,下端切口呈斜型,豎直接種于芽誘導培養基中培養15~20d,分化長成無菌芽苗;所述芽誘導培養基的配方為:WPM基本培養基,附加0.05~0.08mg·L
-16-BA、0.05~0.06mg·L
-1NAA、25~40g·L
-1蔗糖、6.5~7.0g·L
-1卡拉膠,調pH值為5.7~5.8;?(4)體胚誘導:將步驟(3)中長成的無菌苗嫩葉接種到體胚誘導培養基中培養15~30d;MS基本培養基,附加0.16~0.20mg·L
-16-BA、0.2~0.3mg·L
-1NAA、0.08~0.12mg·L
-12,4-D、25~40g·L
-1蔗糖、6.5~7.0g·L
-1卡拉膠,調pH值為5.7~5.8;?(5)體胚增殖培養:將步驟(4)中誘導產生的體胚,進行增殖培養,20~25d后,體胚迅速增殖呈白色或黃色透明顆粒狀;體胚增殖培養基配方為:MS基本培養基,附加1.8~2.0mg·L
-16-BA、0.01~0.03mg·L
-1NAA、25~40g·L
-1蔗糖、6.5~7.0g·L
-1卡拉膠,調pH值為5.7~5.8;?(6)成熟培養:將步驟(5)中增殖獲得的體胚,接種于含有成熟培養基的培養瓶中培養30~50d;體胚成熟培養基配方為:MS基本培養基,附加40~60g·L
-1蔗糖、6.5~7.0g·L
-1卡拉膠,調pH值為5.7~5.8;?(7)體胚的萌發:將步驟(6)中獲得的成熟體胚接種于萌發培養基中培養40~60d進行植株再生;所述體胚萌發培養基配方為:MS基本培養基,附加8~12g·L
-1山梨醇、20~30g·L
-1蔗糖、6.5~7.0g·L
-1卡拉膠,調pH值為5.7~5.8;所述的WPM基本培養基即木本植物培養基的具體配方如下:?
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2.根據權利要求1所述的納塔櫟體細胞胚胎的發生方法,其特征在于:所述步驟(2)中的消毒處理過程包括:將采集的枝條去除2/3葉片后修剪成約4~6cm長的帶腋芽莖段,洗滌劑浸泡30min,流水沖洗10次,蒸餾水清洗外植體后,用無菌水沖洗3~4次,置于無菌燒杯中,在超凈工作臺內用70%的酒精浸泡30s,無菌水沖洗2~3次,再用0.1%升汞溶液消毒3min,最后用無菌水沖洗6次;所述步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)、步驟(6)和步驟(7)中的培養條件為:光照強度為1600~2500lx,每日光照時間為16h,溫度為(25±2)℃。?3.根據權利要求1中一項所述的納塔櫟體細胞胚胎的發生方法,其特征在于:所述的MS基本培養基的具體配方如下:?
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