本發明涉及多聚酶鏈反應（PCR）技術領域，特別是涉及一種多色熒光熔解曲線PCR檢測方法，該檢測方法采用能夠與待測靶標基因特異性雜交的條形碼探針和能夠與條形碼探針特異性結合的熒光檢測探針，對待測樣品中的多個靶標基因同時進行檢測，通過在DNA擴增過程中，生成與每一個待測靶標基因對應的特異條形碼序列，再由條形碼序列經過DNA擴增形成標記了不同熒光基團和淬滅基團的特異性的不同長度的DNA產物，并通過最終的多色熒光熔解曲線分析，從而實現基于熔解曲線分析的PCR多重檢測。

1.一種多色熒光熔解曲線PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：
a、根據待測靶標基因的特異性序列合成一對引物；
b、合成條形碼探針，條形碼探針的3’端為待測靶標基因位于兩條引物之間的探針序
列，5’端為標記淬滅基團的具有一定長度的條形碼序列；
c、合成熒光檢測探針，熒光檢測探針為一條具有莖環結構的序列，其3’端為與所述條
形碼序列特異性結合的條形碼識別序列，5’端序列與3’端序列互補配對，中間為任意一段
與待測靶標基因不相關且與條形碼序列不相關的序列，3’端和5’端分別標記發光基團和淬
滅基團；
d、PCR擴增：
1）每一輪PCR反應中，經過變性步驟之后，在退火步驟，探針序列與待測靶標基因識別，
上游引物和下游引物與待測靶標基因識別；
2）在延伸步驟中，在DNA聚合酶作用下，上游引物和下游引物開始延伸，具有5’-3’外切
核酸酶活性的DNA聚合酶水解探針序列，使條形碼探針的條形碼序列被釋放；
3）進入下一輪PCR反應中，在變性步驟中，熒光檢測探針的莖環結構打開，退火步驟中，
上一輪PCR循環中釋放的條形碼序列與熒光檢測探針的條形碼識別序列特異性結合；
4）進入延伸步驟，條形碼序列以熒光檢測探針為模板合成雙鏈DNA產物；
e、多色熒光熔解曲線檢測分析PCR產物：
在PCR反應結束之后，以熒光檢測探針為模板合成的雙鏈DNA產物，隨著溫度的升高開
始解鏈，發光基團與淬滅基團與DNA鏈一起發生分離，發光基團發出的不同波長的熒光被熒
光PCR儀檢測，根據多色熒光融解曲線分析PCR產物。
2.根據權利要求1所述的一種多色熒光熔解曲線PCR檢測方法，其特征在于：條形碼探
針3’端的探針序列完全與待測靶標基因互補配對，不完全互補配對的條形碼探針不能被具
有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解釋放條形碼序列。
3.根據權利要求1所述的一種多色熒光熔解曲線PCR檢測方法，其特征在于：所述熒光
探針體系包括多個條形碼探針和多個熒光檢測探針，每個熒光檢測探針的莖環結構的序列
長度不同。
4.根據權利要求1、2或3所述的一種多色熒光熔解曲線PCR檢測方法，其特征在于：所述
淬滅基團為Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一種，所述熒光基團為Pacific Blue、
Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、
TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一種。
5.采用權利要求 1至4任意一項所述的多色熒光熔解曲線PCR檢測方法檢測待測基因
的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括：
a、條形碼探針，其3’端為待測靶標基因位于兩條引物之間的探針序列，5’端為標記淬
滅基團的具有一定長度的條形碼序列；
b、具有莖環結構的熒光檢測探針，其3’端為與所述條形碼序列特異性結合的條形碼識
別序列，5’端序列與3’端序列互補配對，中間為任意一段與待測靶標基因不相關且與條形
碼序列不相關的序列，3’端和5’端分別標記發光基團和淬滅基團；
c、耐熱DNA聚合酶；
d、根據待測基因合成的一對引物；
e、dATP、dTTP、dCTP及dGTP；
f、PCR緩沖液。
6.根據權利要求5所述的采用多色熒光熔解曲線PCR檢測方法檢測待測基因的試劑盒，
其特征在于：所述耐熱DNA聚合酶為具有5’-3’外切核酸酶活性的耐熱DNA聚合酶。
7.根據權利要求5所述的采用多色熒光熔解曲線PCR檢測方法的檢測待測基因的試劑
盒，其特征在于：所述PCR緩沖液為含鎂離子、Triton X-100、硫酸銨、氯化鉀、Tris-HCl的混
合溶液。