本發明屬于大腸癌腫瘤細胞原代培養技術領域。包括：1)手術獲取新鮮腫瘤標本，清洗并剪去污穢及壞死區域，碘伏浸泡消毒，采用含雙抗的PBS清洗液清洗；2)將上述腫瘤標本剪成細小組織塊，靜置、去上清液，之后再用含雙抗的PBS清洗液清洗，離心分離，去上清液；3)采用膠原酶消化法或組織塊貼壁法，在培養液中進行組織貼壁及細胞爬出；4)在上述培養液中繼續培養并純化處理，維持細胞生長至所需數量。常規原代培養方法培養良好狀態的大腸癌腫瘤細胞，成功率很低(6％)，本發明所述的原代培養方法可達33％以上，顯著提高了原代大腸癌細胞短期體外培養成功的概率，且工藝簡單易行，成本低，為應用短期生長原代大腸癌細胞的實驗研究提供了一個可供選擇的良好平臺。

1.一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于包括以下工藝步驟：1)從手術室獲取新鮮狀態腫瘤標本，生理鹽水清洗并剪去污穢及壞死區域后，碘伏浸泡消毒5分鐘，采用含雙抗的PBS清洗液清洗；2)在含雙抗的PBS清洗液中將上述腫瘤標本剪成細小組織塊，靜置、去上清液，之后再用含雙抗的PBS清洗液清洗，離心分離，去上清液；3)采用膠原酶消化法或組織塊貼壁法，在培養液中進行組織貼壁及細胞爬出，所述的培養液為10-20％胎牛血清培養液；4)在上述培養液中繼續培養并純化處理，維持細胞生長至所需數量；所述的膠原酶消化法工藝步驟為：a.根據標本組織塊量，按1∶8-12的體積比加入膠原酶消化液，置于37℃水浴搖箱中作用0.5-3小時，至組織塊均呈半毛絮狀或細小顆粒狀，靜置，滴管吸棄上清液；b.離心分離，用滴管吸棄上清液，然后使用無血清DMEM培養液重懸、吹洗混勻，離心，棄上清液；c.在10-20％胎牛血清培養液中以薄量液體培養方式培養48小時后，棄去原培養液，換入足量新培養液，并每3日換一次培養液；所述的組織塊貼壁法工藝步驟為：a.經處理后的標本組織加入無血清DMEM培養液重懸、清洗，離心分離，棄上清液；b.根據標本組織塊量，按1∶8-12的體積比加入膠原酶消化液，置于37℃水浴搖箱中作用20-40分鐘，使組織塊表面間質分離，暴露腫瘤細胞，之后用無血清DEME培養液清洗，靜置沉淀、棄上清液；c.加入純胎牛血清(FBS)，混勻，使標本組織充分浸潤；d.組織塊的種植：將純胎牛血清(FBS)浸泡的組織塊吸至培養瓶或培養皿內，分布均勻，繼續滴加純胎牛血清(FBS)至完全覆蓋培養瓶或培養皿底面，將培養瓶或培養皿緩慢傾斜狀態放置入培養箱內，使組織塊黏附貼壁；e.6-12小時后，加入10-20％胎牛血清培養液，使組織塊剛好被浸沒而不至于浮起，重新水平位放入培養箱內培養，根據組織塊的多少每隔24-48小時換一次培養液。至組織塊貼壁牢固后，加入足量培養液每72小時換液一次；上述膠原酶消化液為含膠原酶1mg/ml和透明質酸酶0.5mg/ml的混合液，過濾無菌后溶于DMEM培養液中。2.如權利要求1所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于所述的純化處理采用機械刮除法，其工藝步驟為：1)標記：顯微鏡下觀察，用標記筆在培養瓶或培養皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；2)刮除：棄掉培養液，于超凈臺內把無菌膠刮或棉簽伸入瓶皿中，肉眼觀察下，刮除無標記空間；3)用PBS清洗液清洗，洗除被刮掉的細胞；4)注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止。3.如權利要求1所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于所述的純化處理采用消化排除法，其工藝步驟為：1)首先用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合消化液漂洗培養細胞，使之浸沒細胞，然后棄去消化液，使細胞處于薄層消化液消化狀態，在倒置顯微鏡下定時觀察并不時搖動培養瓶；2)當見到半數成纖維細胞脫落，腫瘤細胞圈周圍的細胞呈卷狀后，立即加入含血清培養液停止消化，之后輕柔搖動、吹打盤面細胞使成纖維細胞脫落；3)用PBS清洗液輕柔漂洗，將消化液及游浮細胞完全棄去，重復處理后向原瓶內補加新的培養液繼續培養。4.如權利要求1所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于細胞生長至所需數量后，采用0.25％胰酶-0.02％EDTA的混合消化液消化并收集腫瘤單細胞。5.如權利要求1所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于膠原酶消化法中所述的胎牛血清培養液濃度為15-20％。6.如權利要求1所述的一種維持大腸癌腫瘤細胞短期生長的原代培養方法，其特征在于組織塊貼壁法中所述的胎牛血清培養液濃度為10-15％。